月见草茎和月见草籽总黄酮闪式提取工艺优化及抗氧化活性研究
时间：2023-01-20 19:35:07 来源：天一资源网 本文已影响 人 
李 佳， 陈 琦， 林宇青， 张可鑫， 姜 君*
(1.延边大学 农学院，吉林 延吉 133002；
2. 长春市农业科学院,长春 130000)
月见草为一年生或多年生柳叶菜科月见草属植物，其体内所含的多种生物活性成分如γ-亚麻酸[1]、脂肪酸[2]、类固醇[3]已被证实具有抗糖[4]、血脂调节[5]、抗血栓[6]等多种功效，月见草黄酮更是一种天然的抗氧化剂，其优秀的自由基清除能力被广泛应用于食品、医药、美容保健等多个领域[7]。
闪式提取法具有操作简单、耗时少[8]、提取溶剂用量少[9-10]等优点。相较于传统的溶剂提取，闪式提取仪通过机械剪切刀对药物进行切割，同时利用超速动态分子的渗透作用，使药材充分与溶剂作用，能更有效地提取所需活性物质[11]。近年来在多糖、多酚、皂苷、黄酮等多种植物源天然产物的提取工艺研究取得了较大进展[12]。曹伟伟对花生壳中总黄酮的闪式提取条件进行筛选，研究得出在最佳提取条件下，花生壳中总黄酮的平均提取率可达到91.91%[13]，高于热水回流法及超声提取法[14]。
该试验探究闪式提取条件对月见草黄酮提取率的影响，采用响应面法对提取工艺进行优化，同时通过体外抗氧化试验比较不同提取条件下的月见草粗提物抗氧化活性，为今后月见草抗氧化产品的工业化制备提供理论基础。
1.1 材料与试剂
月见草全株购于亳州大德堂药业有限公司；
ABTS、过硫酸钾购于索莱宝科技有限公司；
甲醇购于天津市科密欧化学试剂有限公司；
其他药品均购于国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 单因素试验设计
1) 提取时间的选择
准确称取月见草茎、籽粉末10 g分别按液料比1∶30 (g∶mL)的比例加入100%甲醇溶剂于闪式提取器内，设定提取时间为30、40、50、60、70 s，测定不同提取时间对黄酮提取率的影响。
2) 溶剂体积分数的选择
准确称取月见草茎、籽粉末10 g分别按液料比1∶30 (g∶mL)的比例分别加入60%、70%、80%、90%和100%的甲醇溶剂，提取时间设定为之前所选择的最佳时间，测定不同溶剂体积分数下对黄酮提取率的影响。
3) 料液比的选择
准确称取月见草茎、籽粉末10 g分别按料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40和1∶50 (g∶mL)的比例加入甲醇溶剂，提取时间与溶剂浓度均设置为最佳，测定不同料液比对黄酮提取率的影响。
1.2.2 响应面试验设计
在单因素试验的基础上，以提取时间、甲醇浓度、料液比为响应值，采用三因素三水平响应面分析法，通过Design-Expert.8.06分析软件对月见草黄酮提取工艺进行响应面优化，因素与水平设计见表1。
表1 响应面分析法的因素与水平
1.2.3 溶剂摇床法提取月见草茎、籽总黄酮
准确称取月见草茎、籽粉末10 g分别按料液比1∶20 (g∶mL)的比例加入100%甲醇溶剂于摇床上提取24 h，过滤、收集上清液，重复3次，最终得月见草茎黄酮提取率为67.6 mg/g，月见草籽黄酮提取率为24.7 mg/g。
1.2.4 总黄酮含量的测定
参考李静等[15]的方法并有所改进，称取10 mg芦丁标准品，使用75%乙醇配制成40 μg/mL的芦丁标准液，依次取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4和1.6 mL的芦丁标准液于离心管中定容至2 mL，每管依次加入0.3 mL浓度为5%的NaNO2溶液，混匀静置6 min，再加入0.3 mL 10% Al(NO3)3溶液，混匀静置6 min，最后加入2.0 mL 4% NaOH溶液，混匀后于510 nm下测定吸光度得到标准曲线方程：A=0.029 3 C+0.037 2，R2=0.991 8。根据标准曲线，计算月见草茎、籽粗提物中的总黄酮含量。
1.2.5 月见草茎、籽提取物对DPPH自由基清除率的测定
参照夏秋霞等[16]的方法并有所改进，样品稀释为100、50、25、12、6.25 μg/mL，分别取1 mL样品与等比例0.1 mmol/L DPPH甲醇溶液混合，以100%甲醇代替样品做对照组，混匀后在紫外分光光度计517 nm处测量吸光值。
清除率=(对照组吸光值-样品组吸光值)/对照组吸光值×100%
1.2.6 月见草茎、籽提取物对ABTS自由基清除率的测定
参照臧永军等[17]的方法并有所改进，将7 mmol/L ABTS与2.45 mM过硫酸钾溶液以1∶1的比例混合，避光反应16 h，使用时用无水乙醇将ABTS储备液稀释成OD值为(0.70±0.01)的ABTS工作液。将样品稀释至1.00、0.50、0.25、0.13和0.06 mg/mL，依次取0.2 mL于离心管中，每只离心管加入2 mL的ABTS工作液，以不加ABTS工作液的样品溶液为对照组、以不加样品的ABTS工作液为空白组，于紫外分光光度计734 nm处测量吸光值，计算月见草茎、籽提取物对ABTS自由基的清除率。
清除率=[1-(样品组吸光值-对照组吸光值)/空白组吸光值]×100%
2.1 单因素试验结果
由图1可以看出，月见草茎黄酮提取率随提取时间、料液比、甲醇浓度的变化先升高后降低，分别在提取时间50 s、料液比1∶20 (g∶mL)、甲醇浓度70%达到最大值32.6、53.6和75.6 mg/g。推测随提取时间的延长，机械发热产生的热量使样品中黄酮在高温下受到一定程度的破坏导致提取率下降；
而料液比和甲醇浓度的升高也使样品中其他可溶物对黄酮产生了竞争性抑制，影响了黄酮提取率。
注：图中不同字母表示同一因素不同处理条件间差异显著，即P<0.05，下同
由图2可以看出，当月见草籽提取时间达到60 s时，总黄酮提取率最高，达到11.6 mg/g；
随着料液比的增加，总黄酮提取率呈现出先上升后下降的趋势，并于料液比1∶20时达到最大值15.4 mg/g；
甲醇浓度为70%时，月见草籽中的黄酮提取率显著高于其它处理组，为26.7 mg/g。因此，选择提取时间60 s，料液比1∶20，甲醇浓度70%为响应面优化因素。
图2 提取时间(A)、料液比(B)、甲醇浓度(C)对月见草种子提取物中总黄酮产率的影响
2.2 响应面试验结果
根据单因素试验结果，采用Box-Behnken中心组合试验设计，对月见草茎的提取工艺进行优化，结果见表2。
表2 月见草茎提取的响应面试验设计及其结果
通过Design-Expert 8.0.6.1软件对数据进一步进行拟合分析，从而得到总黄酮得率的提取时间(A)、料液比(B)及甲醇浓度(C)编码值的二次回归模型方程。
总黄酮得率=+73.99+2.08A+0.967 5B+0.627 5C+1.14AB-0.305 0AC-0.195 0BC-2.39A2+0.412 5B2-2.28C2
由月见草茎方差分析结果可知，该模型回归显著(P<0.01)失拟项(P=0.073 6)不显著，表明自变量与响应值之间的模型关系显著，说明回归方程与实际情况拟合良好，可以用此模型来分析和预测月见草茎总黄酮得率的提取结果。
由软件分析各因素对月见草茎总黄酮提取率影响的二维等高线图及三维响应曲面图如图3所示，当提取液浓度取零点值时，提取时间与料液比两者之间相互影响不显著，两者之间的等高线呈现不规则形；
由效应面的陡峭程度可判断出提取时间与料液比交互作用显著；
当提取时间取零点值时，甲醇浓度与料液比之间的二维等高线无闭合，说明二者之间交互作用不显著，结果与方差分析结果相符。
根据单因素试验结果，采用Box-Behnken中心组合试验设计，对月见草籽的提取工艺进行优化，结果见表3。
表3 月见草种子提取的响应面试验设计及其结果
通过Design-Expert 8.0.6.1软件对数据进一步进行拟合分析，从而得到总黄酮量提取时间(A)、料液比(B)及甲醇浓度(C)编码值的二次回归模型方程，由方差分析结果得总黄酮得率=+25.72+0.548 8A-0.011 9B-1.09C-1.02AB-2.23AC+0.071 3BC-2.39A2-1.49B2-1.73 C2
由软件分析各因素对月见草籽总黄酮提取率影响的二维等高线图及三维响应曲面图如图4所示，由效应面的陡峭程度可判断出提取时间与甲醇浓度交互作用显著，提取时间与料液比、甲醇浓度与料液比的交互影响不显著，与方差分析结果相符。
图3 月见草茎提取的响应面分析图及等高线分布图
2.3 最优提取工艺验证
拟合的最优结果及结果验证如表4～5所示，由于时间无法精准把控，故在实际工艺上进行了调整。最终月见草茎在提取时间50 s、料液比1∶19.4 (g∶mL)、甲醇浓度68%时黄酮提取率为75.6 mg/g；
月见草籽在提取时间61 s、料液比1∶20.3 (g∶mL)、甲醇浓度71%时黄酮提取率达到25.8 mg/g，远优于摇床法。
图4 月见草种子提取的响应面分析图及等高线分布图
表4 月见草茎提取的响应面分析结果的验证
表5 月见草种子提取的响应面分析结果的验证
2.4 月见草茎、籽提取物的抗氧化活性
2.4.1 DPPH自由基清除能力的测定
不同浓度与不同提取工艺的月见草茎提取物清除DPPH自由基能力如图5所示。从图5可以看出，月见草茎提取物对DPPH自由基的清除能力随浓度升高而增加，闪式提取法清除能力略低于VC，远高于摇床法，高浓度下几乎与VC持平；
说明在这一浓度下，闪式提取法的月见草茎提取物有着较好的DPPH自由基清除率。
图5 月见草茎提取物对DPPH自由基清除活性的影响
不同浓度与不同提取工艺的月见草籽提取物清除DPPH自由基能力如图6所示。由图6可知，月见草籽提取物有一定的DPPH清除能力，但低浓度表现不佳，与VC之间仍有差距；
其中，闪式提取法的月见草籽提取物对DPPH的清除能力最佳，远高于摇床提取。高浓度的月见草籽提取物或可用以替代VC的DPPH清除作用。
图6 月见草种子提取物对DPPH自由基清除活性的影响
2.4.2 ABTS自由基清除能力的测定
由图7可知，VC和月见草茎提取物对ABTS自由基均表现出良好的清除能力，且呈量效关系，闪式提取法所得提取物对ABTS自由基的清除能力略低于VC，略高于摇床法。2种提取方法下的提取物ABTS自由基清除力基本持平，说明摇床法并不会过多损伤月见草茎的ABTS自由基清除能力。
图7 月见草茎提取物对ABTS自由基清除活性的影响
由图8可知，月见草籽提取物的对ABTS自由基有一定的清除力，且随着质量浓度的升高也在不断增强，在测定的质量浓度范围内、高浓度下闪式提取法与摇床法对ABTS自由基的清除力几乎一致，但仍然低于对照品VC的清除力。
图8 月见草种子提取物对ABTS自由基清除活性的影响
近年来，植物有效物质的提取主要有水提法、有机溶剂提取法、酶提法和超声波辅助提取法，但普遍存在提取时间长、耗材量大、提取效率低、产物活性差等种种弊端[18]。闪式提取作为一种新兴提取方式，利用负压渗透作用和高速剪切作用，促进植物细胞快速破壁粉碎，在短时间内使植物组织与提取溶剂充分作用，耗时更短、提取效率更高、能最大限度保护植物有效成分[19]。
而响应面实验设计通过拟合各因素与响应值之间的函数关系，借以推测出闪式提取月见草茎、籽黄酮的最优工艺参数：当提取条件为提取时间50.32 s，料液比1∶19.4 (g∶mL)，甲醇浓度68%时月见草茎的总黄酮提取率为76.8 mg/g，当提取条件为提取时间60.72 s，料液比1∶20.3 (g∶mL)，甲醇浓度71%时月见草籽的总黄酮提取率为27.1 mg/g，显著高于其它提取条件所得总黄酮[20]。且经该提取方法所得粗提物已被验证有较好的抗氧化活性[21-22]，为其在食品、药品等领域开发天然抗氧化剂的工业化生产提供一定的理论依据。
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