板蓝根颗粒需氧菌总数测定不确定度分析
时间：2023-01-20 15:35:15 来源：天一资源网 本文已影响 人 
刘文杰，井良义，郝运伟，王 君，牛振东
（北京市药品检验研究院·中药成分分析与生物评价北京市重点实验室，北京 102206）
需氧菌总数是2020年版《中国药典》中非无菌产品微生物限度检查项目，也是评价药品安全性的重要指标，可反映药品生产过程中是否符合生产要求［1-3］。微生物限度检查结果受到样品中微生物分布均匀，样品称量、制备过程，不同检验人员操作手法等因素的影响。测定不确定度是表征赋予被测量值分散性的非负参数［4-5］，由若干分量构成，可通过不确定度的A类和B类评定，用标准偏差表征。实验室认证认可明确要求，可采取多方式对检测实验室有数值要求的参数进行不确定度评估，以保证检验检测数据结果的可靠性［6］。为实现检验结果的可靠性，中国合格评定国家认可委员会对检测和校准实验室提出了应做测定不确定度的要求［7-8］。本研究中参考2020年版《中国药典（四部）》通则1105，依据标准《测量不确定度评定与表示》（JJF1059.1-2012）对药品微生物限度检查项目中的需氧菌总数进行A类和B类不确定度评定，建立本实验室微生物不确定度评定方法，提高检验结果的可靠性，查找试验过程的关键操作点，为更好地指导检验机构的检验检测工作，以及建立同类制剂检测的测量不确定度评定方法提供依据［9］。现报道如下。
1.1 仪器
DL-CJ-2ND型超净工作台（北京东联哈尔仪器制造有限公司）；
1300 SERIES A2型生物安全柜、DLHPQ200型恒温摇床（美国Thermo Scientific公司）；
LRH-250型生化培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；
BIST-A-D型电热脉动真空灭菌器（山东新华医疗器械股份有限公司）；
ME1002T型电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）。
1.2 试药
板蓝根颗粒（厂家A，规格为每袋5 g）；
pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（北京奥博星生物技术有限公司，批号为20201010）；
胰酪大豆胨琼脂（TSA）培养基（批号为8053765）、沙氏琼脂培养基（批号为815577），均购自美国BD公司。
2.1 溶液制备
供试液：取样品10 g，精密称定，置100 mL容量瓶中，加pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液定容，摇匀，使样品分散均匀，制成供试液Ⅰ。精密量取10 mL，加pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液90 mL，混匀，即得供试液Ⅱ。
供试品组供试液：取供试液Ⅰ10 mL，加入pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液0.1 mL，混匀，即得。
菌液组供试液：取pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10 mL，加入制备好的试验菌液0.1 mL（300～1 000 cfu），混匀，制成每1 mL稀释液中含菌量30～100 cfu的菌液。
试验组供试液：分别取供试液Ⅰ10 mL和制备好的试验菌液0.1 mL，混匀，即得。
2.2 需氧菌培养与计数
取供试液Ⅱ，逐级（10倍）稀释，每个稀释级各取1 mL至平皿，平行2个平皿，倾注TSA培养基适量，33℃培养5 d，计数。另取pH 7.0无菌氧化钠-蛋白冻缓冲液1 mL至平皿，作为阴性对照，平行2个平皿，由同一名人员操作。由公式A=KX/V计算需氧菌总数，其中，K为稀释倍数，X为进入TSA培养基的2个平皿平均菌落数，V为该稀释级下的取样体积，一般V取1 mL，单位为cfu/g。
2.3 不确定度来源分析
回顾整个试验过程，发现影响检测结果不确定度的主要因素有样品均匀性、检测人员的不同，以及取样重复性，在称量过程中天平的使用，样品稀释过程中量筒和吸管的使用。本研究中主要对后三者引入的不确定度进行评定。
2.4 方法学考察
试验分为供试品组、菌液组和试验组，分别以2.1项下相应供试液处理，每组均平行3个平皿，除霉菌和酵母菌以沙氏琼脂培养基于33℃下培养5 d外，其余菌种均以TSA培养基培养3 d后，采用平皿法计数。结果见表1。
2.5 不确定度分量评定
2.5.1 A类不确定度评定
对重复性测量的不确定度进行评定。需氧菌总数检测中有同一人对同一个样品按照药典规定进行操作，数据的发散性较大，故对检测数据取对数再进行计算。采用极差法评定重复测量的不确定度，对20份注入TSA培养基的供试液Ⅰ的重复2次检验结果取对数，计算结果的均值和残差平方和，结果见表2。计算合并标准偏差为
表1 方法适用性考察结果Tab.1 Investigation results of the applicability of the method
2.5.2 B类不确定度评定
样品称量引入不确定度：采用电子天平称取样品，电子天平的分度值为0.01 g，最大量程为1 200 g，检定分度值为0.1 g，根据JJG1036-2008标准中电子天平检定规程，电子天平的允许误差为±0.1 g，天平最大允许误差（MPE）认为矩形均匀分布，样品由二次称量完成。标准不确定度Um=0.1/3=0.057 7，相对标准不确定度Urel（m）=Um/m=0.057 7/10=0.005 8。
表2 检验结果及分析Tab.2 Testing results and analysis
样品稀释引入不确定度：取样品适量用量筒加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液90 mL，置100 mL容量瓶中，定容，混匀，制成1∶10（m/V）稀释液。用校准级别为A级的10 mL吸管吸取9 mL pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，用校准级别为A级的1 mL吸管取1 mL（1∶10，m/V）至9 mL pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中制成1∶100（m/V）稀释液，依此类推。稀释过程引起的相对不确定度见表3。
表3 稀释过程引入的相对不确定度Tab.3 Relative uncertainty induced by dilution process
2.5.3 合成不确定度评定
2.5.4 扩展不确定度评定
本研究中考察了20组测量结果，置信区间（CI）为95%，自由度（df）为19.00，查t0.025分布表可知K=2.093，故扩展不确定度为，U=KUc（lgX）=2.093×0.044 0=0.092 1。
2.6 需氧菌计数结果
本研究中需氧菌总数（Y）为，Y=lgX±U=（2.696 8±0.092 1）cfu/g，即2.604 8≤Y≤2.788 9。取反对数，95%CI时20份样品需氧菌总数为402～615 cfu/g。任一样品的需氧菌总数均可根据Y=lgX±0.092 1估算，如第一个样品，2.761 4±0.092 1，取反对数为需氧菌总数为466～713 cfu/g。
对于检验检测机构，测量结果不确定度评定既是《检测和校准实验室能力认可准则》（CNAS-CL01）的要求，又是实验室质量评价与改进的重要参考，也是实验数据可靠性的重要保障。近年来在食品领域菌落总数定量检测均有测量不确定度的报道，药品领域也有一定报道。吕婷婷等［10］对板蓝根颗粒霉菌和酵母菌总数进行了不确定度的评定。王娟等［11］对荆防颗粒需氧菌总数的不确定度进行了考察。需氧菌总数作为微生物限度检查项目之一，是保障药品安全的重要指标。本研究中建立了板蓝根颗粒需氧菌总数的不确定度分析方法，可以为实验室同剂型制剂的相关检测提供参考。
本研究中列出了天平、量筒和吸管等引入不确定度分量，基于培养基、培养箱、培养条件、实验室温湿度等引入的不确定度不易量化［12］，对合成不确定度的贡献较小，可以通过规范实验室操作，制订相应的作业指导书，定期对实验环境进行监控，强化人员培训等减少这些不确定度因素的引入［13］。
虽然当前不确定度评定技术在微生物检测领域应用较少，随着检测机构对不确定度评定认识的加深，在对微生物检测结果进行判定时将会得到更广泛的应用。通过对药品需氧菌总数测定不确定度的评价能客观地反映实验室检测结果的可靠性和有效性，降低误判概率，从而减少检测机构的风险。
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