钙离子对仙草胶-鱼糜凝胶特性和体外消化性的影响
时间：2023-01-13 16:50:07 来源：天一资源网 本文已影响 人 
游 刚，张自然，李 莹，牛改改
（北部湾大学食品工程学院，广西高校北部湾特色海产品资源开发与高值化利用重点实验室，钦州市特色果蔬发酵重点实验室，广西钦州 535011）
鱼糜制品是一种低脂肪、高蛋白食品，备受消费者喜爱。随着生活质量的不断改善，消费者更加追求食品感官享受，更加注重食品营养和健康。为丰富食品质地和营养以满足消费者对鱼糜制品多元化需求，研究者向鱼糜中添加多糖、Ca等外源物质，以改善鱼糜凝胶结构特性和营养功能性。工业生产上，Ca常用于改善鱼糜制品功能特性。研究表明Ca可激活鱼糜中内源转谷酰胺酶活性，也可与蛋白质以离子键形式形成钙桥结构，进而增强鱼糜凝胶特性。仙草胶（hsian-tsao gum，HG）的主要成分是一种从药食两用草本植物仙草（又称凉粉草）中提取的阴离子杂多糖，具有良好的生物活性（抗氧化性、降血脂等活性）和促凝胶性。前期研究发现，HG可改善鱼糜凝胶感官特性和质构特性，归因于HG -鱼糜蛋白相互作用，促进鱼糜凝胶作用力形成（氢键、疏水作用力和二硫键）；
另外，Ca与HG富含的糖醛酸-COOH结合形成钙桥结构，促进HG凝胶化。在此基础上，发现添加适量Ca可改善HG-鱼糜凝胶质构特性，推测与HG-Ca-鱼糜蛋白质相互作用有关，然而，Ca对HG-鱼糜凝胶特性的影响规律尚不清晰。因此，本实验以HG-鱼糜为研究对象，探讨添加不同浓度Ca对HG-鱼糜复合凝胶感官特性、凝胶特性（凝胶强度、质构特性、凝胶形成作用力、微观结构）和体外消化性的影响，为Ca在HG-鱼糜凝胶产品中的应用提供理论参考。
1.1 材料与仪器
罗非鱼（约1.0 kg）、干仙草 广西钦州市东风市场；
牛血清蛋白（生化试剂） 上海源叶生物科技有限公司；
胃蛋白酶（3000 U/mg）、胰蛋白酶（250 U/mg）西安拉维亚生物科技有限公司；
浓盐酸、氢氧化钠、无水乙醇、硫酸铜、酒石酸钾钠、牛血清蛋白、十二烷基硫酸钠SDS、三氯乙酸TCA、尿素、-巯基乙醇 分析纯， 国药集团化学试剂有限公司。
FJ-200型组织捣碎机 上海样品和模型厂；
CT3质构仪 美国Brookfield公司；
KN580全自动凯氏定氮仪 济南阿尔瓦仪器有限公司；
Evolution-201紫外分光光度计 赛默飞世尔科技（中国）有限公司；
BX53荧光显微镜 日本Olympus公司。
1.2 实验方法
1.2.1 样品制备 参考LIN等的方法制备仙草胶HG，并稍作修改。100 g干草加入1 L 95%（v/v）乙醇浸泡10 h，干燥后加入2 L 0.14 mol/L NaHCO溶液，95 ℃回流提取120 min，分离收集上清液，加入无水乙醇至 80%（v/v）于 4 ℃ 过夜，离心（5000×g，10 min），沉淀复溶、透析（8000～14000 Da），冻干备用。基本成分（g/100 g，干基）：多糖 48.81±1.23，蛋白质 9.55±0.35，脂肪 3.86±0.15，灰分 17.54±0.65。
采用二段加热法（40 ℃，30 min；
90 ℃，20 min）制备含不同Ca浓度的仙草胶-鱼糜复合凝胶。鱼肉经去皮、骨后，加盐（2.0%，w/w）搅拌（1800 r/min）3 min，加入0.15%（w/w）HG 和 CaCl（0、3、6、9、12 mmol/kg），调整水分含量至80%，继续搅拌（2500 r/min）4 min，灌肠（直径45 mm），加热，冰浴、冷却后于4 ℃储藏过夜，备用。斩拌过程控制样品温度不超过10 ℃，样品 pH6.9～7.2。
1.2.2 感官评价 参考文献[10-11]，并稍作修改。依据《GB/T 16291.1—2012感官分析 选拔、培训与管理评价员一般导则》，组建感官评价小组，由20～45岁食品专业的5名男性和3名女性组成。评价员先充分熟悉样品特性，并经讨论后，确定反映样品的主要评价指标（弹性、硬度、组织状态、色泽），按表1感官评价标准进行评价。
表1 感官评价标准Table 1 Sensory evaluation criteria
1.2.3 持水率测定 样品切成3 mm薄片，质量为w（g），用吸水纸包裹置于离心管，离心（6000×g）10 min，质量为 w（g）。
1.2.4 凝胶强度测定 参考文献[1]，样品切成直径20 mm×高25 mm大小的圆柱体，采用质构仪测定。
1.2.5 全质构（TPA）测定 参考文献[1]，样品切成直径20 mm×高25 mm大小的圆柱体，采用质构仪测定。
1.2.6 凝胶形成作用力测定 参考ZHANG等的方法测定，并稍作修改。称取2.0 g样品，放入10 mL的离心管，分别加入5 mL的SA溶液（0.05 mol/L NaCl）、SB 溶液（0.6 mol/L NaCl）、SC 溶液（0.6 mol/L NaCl+1.5 mol/L尿素）、SD溶液（0.6 mol/L NaCl+8.0 mol/L尿素）和SE溶液（0.6 mol/L NaCl+8.0 mol/L尿素+0.5 mol/L-巯基乙醇）混合均质（1600 r/min）30 s，置于4 ℃的冰柜中静置1 h，然后经5000 r/min的转速下进行离心10 min，采用Lowry法测定蛋白质浓度。凝胶形成作用力采用溶解于不同溶剂的蛋白质浓度差表示：离子键=SB-SA；
氢键=SC-SB；
疏水作用力=SD-SC；
二硫键=SE-SD。
1.2.7 凝胶溶解率测定 参考BALANGE等方法测定，并稍作修改。取1.0 g样品加入20 mL 20 mmol/L Tris-HCl（含 1% SDS，2%-巯基乙醇和8.0 mol/L尿素）均质，煮沸2 min，室温振荡4 h，离心（10000 r/min，30 min），取上清液 10 mL，添加50% TCA（w/v）至终浓度为10%，于4 ℃过夜，离心（10000 r/min，30 min），用 10%（w/v）TCA 冲洗沉淀，溶解于0.5 mol/L NaOH，采用Lowry法测定蛋白质浓度。样品溶解率=溶解于溶剂中的蛋白质含量/总蛋白质含量（直接溶解于0.5 mol/L NaOH溶液）。
1.2.8 凝胶微观结构 参考文献[1, 14]，采用光学显微镜观察经1%溴酚蓝染色凝胶结构并用ImageJ 1.53软件处理计算其孔隙率。
1.2.9 凝胶体外消化率测定 参考文献[1, 15]测定。取1.0 g样品（干基）加入25 mL去离子水，10000×g均质1 min，备用。胃蛋白酶消化实验：用1 mol/L HCl将样品调至pH2.0，根据样品质量，以1:30加入胃蛋白酶（3000 U/mg），37 ℃ 振荡消化2 h，用1 mol/L NaOH调pH至8.0灭酶（胰蛋白酶最适pH），离心（10000g，20 min），沉淀冻干，备用；
胰蛋白酶消化实验：相同步骤完成胃蛋白酶消化，以1:40添加胰蛋白酶（250 U/mg），37 ℃ 下振荡消化 2 h，离心（10000×g，20 min），沉淀冻干，备用。采用凯式定氮法测定蛋白质含量，体外消化率计算如下（以干基计算）：
式中：W：消化前蛋白质含量（mg/g 样品），W：消化后蛋白质含量（mg/g样品）。
1.3 数据处理
采用SPSS 19.0软件对3次重复实验据统计分析，结果采用平均值±标准偏差表示，采用 Duncan多重检验进行显著性分析（＜0.05），Origin 2021作图并进行主成分分析。
2.1 Ca2+对HG-鱼糜凝胶感官特性的影响
添加不同浓度Ca对HG-鱼糜凝胶感官特性的影响如图1所示。与未添加组相比，随着Ca浓度的增大，凝胶弹性、硬度和组织状态评分均呈现先增大后减小的趋势，且均在添加3 mmol/kg Ca时达到最大值；
凝胶色泽评分呈现逐渐增大的趋势。结果表明添加Ca对HG-鱼糜凝胶感官特性具有显著影响（＜0.05），这可能与 Ca参与 HG-鱼糜凝胶网络结构的形成，改变凝胶质构特性和微观结构有关。
图1 不同浓度Ca2+对仙草胶-鱼糜凝胶感官特性的影响Fig.1 Effects of different concentration of Ca2+ on sensory properties of HG-added surimi gels
2.2 Ca2+对HG-鱼糜凝胶持水率的影响
不同浓度Ca对HG-鱼糜凝胶持水率的影响如图2所示。凝胶持水率随Ca浓度的增加先升高后降低；
与未添加组（91.01%）相比，添加3和6 mmol/kg Ca时，凝胶持水率分别增加1.10%和降低3.30%；
然而，添加9和12 mmol/kg Ca时，凝胶持水率分别显著降低至86.10%和83.04%（＜0.05）。这与加入CaCl的盐析作用增强有关，导致蛋白质聚集速率增大，凝胶结构形成较大且不均匀的孔洞（图5），进而降低其持水率。暴伊芮等研究发现高浓度Ca降低海鲈鱼糜持水率，与本研究结果相似。前期研究发现，加入的阴离子多糖HG能够与蛋白质相互作用，形成紧密均匀的凝胶结构，提高了鱼糜凝胶的持水性；
然而加入低浓度Ca（≤6 mmol/kg）并未显著增加HG-鱼糜凝胶持水率，与文献报道结果不同，分析其原因可能是由于HG影响Ca-蛋白质相互作用。由于Ca可同时促进HG和蛋白质聚集，进而减弱了HG-蛋白质的相互作用，增大了凝胶网络结构孔洞体积（图5），降低了其持水率。
图2 不同浓度Ca2+对仙草胶-鱼糜凝胶持水率的影响Fig.2 Effects of different concentration of Ca2+ on waterholding capacity of HG-added surimi gels
图5 不同浓度Ca2+对HG-鱼糜凝胶微观结构的影响Fig.5 Effects of different concentration of Ca2+ on the microstructure of HG-added surimi gel
2.3 Ca2+对HG-鱼糜凝胶强度的影响
不同浓度Ca对HG-鱼糜凝胶强度的影响如图3所示。随着Ca浓度增大，HG-鱼糜凝胶强度呈现先增大后减小的趋势，添加3 mmol/kg Ca时凝胶强度最大，较未添加组显著增加了28.18%（＜0.05）；
继续增大Ca浓度至6和9 mmol/kg时凝胶强度均降低，较未添加组分别显著增加了14.34%和9.24%（＜0.05）；
然而，Ca浓度增大至 12 mmol/kg 时凝胶强度较未添加组显著减少6.06%（＜0.05）。低浓度Ca增大鱼糜凝胶强度的原因如下：a.Ca激活鱼肉内源性酶（转谷氨酸酰胺酶）活性，催化肌球蛋白分子重链共价交联，增大凝胶强度；
b.低浓度Ca形成的盐溶效应有利于蛋白质结构伸展，内部活性基团暴露，有利于增强相互作用力，例如：疏水作用力和二硫键等，进而增大凝胶强度；
c.Ca促进仙草胶凝胶化，可有效填充鱼糜凝胶网络，增大凝胶强度。然而，高浓度Ca减小鱼糜凝胶强度归因于：a.转谷氨酸酰胺酶催化活性降低；
b.盐析作用诱导的蛋白质快速聚集形成不均一的网络结构。暴伊芮等研究发现低浓度Ca增加海鲈鱼糜凝胶强度，高浓度Ca降低其凝胶强度，与本研究结果相似。因此，添加低浓度Ca，特别是添加3 mmol/kg Ca可显著提高HG-鱼糜凝胶强度。
图3 不同浓度Ca2+对仙草胶-鱼糜凝胶强度的影响Fig.3 Effects of different concentration of Ca2+ on gel strength of HG-added surimi gels
2.4 Ca2+对HG-鱼糜凝胶质构特性的影响
不同浓度Ca对HG-鱼糜凝胶质构特性的影响如表2所示。增大Ca浓度可改变HG-鱼糜凝胶的硬度和弹性，均呈现先增加后减小的趋势，且在添加3 mmol/kg Ca时均达最大值，较未添加组分别增加7.65%和0.41%，而凝胶内聚性和咀嚼性变化不明显。暴伊芮等发现添加Ca可增大鱼糜凝胶硬度；
鲍佳彤等发现添加0.4% TGase时，增大Ca浓度，糜凝胶硬度和弹性先增大后降低；
结果表明鱼糜凝胶网络结构的形成与Ca-内源性酶（TGase）-蛋白质相互作用有关。前期研究发现HG-鱼糜蛋白质存在相互作用，据此推测HG-鱼糜蛋白相互作用影响Ca-内源性酶（TGase）-蛋白质相互作用，进而改变凝胶硬度。此外，HG-鱼糜凝胶硬度变化趋势与凝胶强度变化结果（图3）一致，表明低浓度Ca可促进HG-鱼糜凝胶网络结构形成，增大凝胶强度和硬度。
表2 不同浓度Ca2+对HG-鱼糜凝胶质构特性的影响Table 2 Effects of different concentration of Ca2+ on texture properties of HG-added surimi gels
2.5 Ca2+对HG-鱼糜凝胶形成作用力和溶解率的影响
蛋白凝胶经不同溶剂溶解后可溶性蛋白质浓度的变化，可间接反映凝胶形成过程中分子间作用力的变化。不同浓度Ca对HG-鱼糜凝胶可溶性蛋白质浓度的影响如图4a所示。与未添加组相比，添加Ca显著降低二硫键、离子键和氢键作用力，显著增大疏水作用力（＜0.05），表明 Ca影响 HG-鱼糜蛋白相互作用。尽管添加3 mmol/kg Ca时其二硫键含量较未添加组降低，但其疏水作用力显著增加（＜0.05），且凝胶强度、硬度和弹性均达最大值；
继续增加Ca浓度，其凝胶二硫键、氢键和疏水作用力均显著降低（＜0.05），且凝胶强度（图3）、硬度和弹性（表2）均降低，由此可推测二硫键、氢键和疏水作用力变化对凝胶质构特性产生一定影响。二硫键含量与蛋白质含硫氨基酸残基数量有关；
Ca-蛋白质相互作用阻碍蛋白质分子链交联，减弱二硫键作用。凝胶形成疏水作用力增强归因于Ca-HG-蛋白质相互作用促使蛋白质结构伸展，暴露更多的疏水性基团，促进蛋白质聚集。另外，随着Ca浓度增大，其氢键作用力逐渐减小，归因于Ca水化以及Ca促进HG凝胶化，均与鱼糜蛋白竞争性结合水分，减弱了蛋白质-水之间的氢键作用力，增强蛋白质表面疏水性环境。氢键作用力变化与图2显示的凝胶持水率变化结果一致，表明氢键作用力与凝胶持水性具有一定程度上的正相关性。随着Ca浓度增大，离子键作用力逐渐减小，表明鱼糜凝胶化过程中蛋白质结构被破坏，受添加物（Ca、HG）和温度等因素的影响。
由于含SDS、尿素和-巯基乙醇的溶剂不能断裂非二硫共价键，例如-（-Glu）-Lys 共价键，因此，利用该溶剂溶解鱼糜，其溶解率越低，表明鱼糜凝胶中非二硫共价键含量越高。不同浓度Ca对HG-鱼糜凝胶溶解率的影响如图4b所示。随着Ca浓度增大，HG-鱼糜凝胶溶解率呈现先降低后升高的趋势；
添加3 mmol/kg Ca时凝胶溶解率最低，较未添加组降低46.15%；
尽管继续增加Ca浓度，凝胶溶解率增大，但较未添加组均显著降低（＜0.05）。结果表明添加Ca可促进凝胶非二硫共价键的形成。图4a显示，添加3、6、9 mmol/kg Ca时凝胶二硫键含量较未添加组显著降低（＜0.05），但图3显示其凝胶强度较未添加组显著增大（＜0.05），表明非二硫共价键对凝胶强度贡献较大；
特别是添加3 mmol/kg Ca时的凝胶强度（图3）、硬度和弹性（表2）均达最大值与其较大非二硫共价键含量有关。然而，添加12 mmol/kg Ca时凝胶溶解率较未添加组显著降低，同时其凝胶强度和硬度均显著降低，表明二硫键和非二硫共价键含量对凝胶质构特性具有决定性影响。因此，添加低浓度Ca可增加凝胶形成疏水作用力和非二硫共价键含量，改善HG-鱼糜凝胶特性。
图4 不同浓度Ca2+对仙草胶-鱼糜凝胶形成作用力（a）和凝胶溶解率（b）的影响Fig.4 Effects of different concentration of Ca2+ on the intermolecular forces (a) and solubility (b) of HG-added surimi gels
2.6 Ca2+对HG-鱼糜凝胶微观结构的影响
添加不同浓度Ca对HG-鱼糜凝胶微观结构的影响如图5所示。添加Ca影响HG-鱼糜凝胶形成作用力，进而改变凝胶结构，其孔隙率大小为：18.80%（12 mmol/kg）＞13.75%（0）＞13.71%（9 mmol/kg）＞12.13%（6 mmol/kg）＞11.11%（3 mmol/kg）。由于 Ca-HG-蛋白质相互作用，蛋白质-水相互作用减弱，其疏水相互作用力增大；
此外，体积排空作用促进相邻蛋白质表面聚集形成多孔凝胶网络结构。添加3 mmol/kg Ca时，凝胶强度（图3）、硬度和弹性（表2）最大与HG-鱼糜凝胶孔隙率较低有关。因此，添加低浓度Ca可促进HG-鱼糜凝胶网络结构形成，改善凝胶质构特性。
2.7 Ca2+对HG-鱼糜凝胶体外消化性的影响
采用体外消化模型，分析不同浓度Ca对HG-鱼糜凝胶体外消化性的影响，结果如图6所示。随着Ca浓度增大，样品分别经胃蛋白酶、胃蛋白酶+胰蛋白酶消化后，样品消化率均呈现先减小后增加的变化趋势，且经胃蛋白酶+胰蛋白酶消化后的HG-鱼糜凝胶消化率高于胃蛋白酶组。由于添加Ca影响复合鱼糜凝胶强度、硬度、弹性和溶解率，改变凝胶形成作用力（图4a）和微观结构（图5），进而影响凝胶的体外消化率。添加3 mmol/kg Ca时凝胶消化率最低与其较低的溶解率（图4b）和较高的凝胶强度（图3）、硬度（表2）有关，这与SEMEDO等报道的蛋白质消化性与硬度呈现显著负相关性结论一致；
另外，较低凝胶消化率与凝胶形成较少孔隙率的网络结构有关（图5），紧密的网络结构对酶-蛋白质结合产生一定位阻作用。继续增加Ca浓度，凝胶样品体外消化率显著增加，且在9 mmol/kg Ca后显著高于未添加组（＜0.05），其形成原因如下：a.凝胶溶解率和结构孔隙率增加，多孔结构有利于酶-蛋白质结合；
且凝胶强度、硬度和弹性均减小，有利于凝胶体外消化；
b.Ca具有激活酶活性功能，添加一定浓度Ca促进酶解作用，进而提高凝胶消化率。因此，Ca对HG-鱼糜凝胶体外消化率受凝胶结构孔隙率和质构特性变化影响。
图6 不同浓度Ca2+对HG-鱼糜凝胶体外消化率的影响Fig.6 Effects of different concentration of Ca2+ on the digestibility of HG-added surimi gel in vitro
2.8 凝胶特性、感官特性与体外消化性相关性分析
由图7可知，经主成分分析（PCA），PC1和PC2的总贡献率超过85%，表明PCA能较好反映原始高维矩阵数据信息。样品出现在3个不同区域，可将样品聚类为 3组（Ca-0；
Ca-3和 Ca-6；
Ca-9和Ca-12），表明添加 Ca显著影响 HG-鱼糜凝胶特性。凝胶感官特性（硬度-SC、弹性-SC和组织状态-SC）与凝胶质构特性（硬度、弹性）、凝胶形成作用力（二硫键、氢键和离子键）和持水率呈正相关性。凝胶消化率与微观结构孔隙率和凝胶溶解率呈正相关性，与凝胶强度、硬度、弹性、持水率和凝胶形成作用力（二硫键、离子键、氢键）呈负相关性。
图7 HG-鱼糜复合凝胶特性和消化率之间的PCA双标图Fig.7 PCA biplot among gel properties and digestibility of HG-added surimi gel
添加Ca减少HG-鱼糜凝胶二硫键、离子键和氢键作用力，增加其疏水作用力和非二硫共价键含量，进而影响凝胶持水率、凝胶特性（凝胶强度、硬度和弹性）和结构孔隙率。添加3 mmol/kg Ca可改善HG-鱼糜凝胶感官特性（弹性、硬度和组织状态）、凝胶强度、质构特性（硬度、弹性）和持水率，微观结构紧密，孔隙率较小，但凝胶溶解率和体外消化率降低；
继续增加 Ca浓度（＞3 mmol/kg），HG-鱼糜凝胶感官特性、凝胶强度、质构特性（硬度、弹性）和持水率均降低，微观结构孔隙率增大，但凝胶溶解率和体外消化率增加。经主成分分析，凝胶消化率与结构孔隙率和凝胶溶解率呈正相关性，与凝胶强度、硬度、弹性、持水率和凝胶形成作用力（二硫键、离子键、氢键）呈负相关性。因此，添加低浓度Ca可改善HG-鱼糜凝胶感官特性和凝胶结构特性，改变Ca浓度可设计不同感官特性和凝胶特性的HG-鱼糜凝胶，具有潜在的应用价值。后续实验将进一步从Ca-HG-蛋白质/内源酶相互作用角度分析Ca对复合凝胶结构特性的影响机制，为HG-鱼糜凝胶产品多元化开发提供理论参考。
