绿萼梅抗β淀粉样蛋白致阿尔茨海默病细胞模型活性部位的筛选及其化学成分分析
时间：2023-01-25 12:30:05 来源：天一资源网 本文已影响 人 
甘宜杰，张 伟,2,3，欧金梅,2，乔金为,4，金传山
(1.安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 230012；
2.新安医学教育部重点实验室，安徽 合肥 230038；
3.中药研究与开发安徽省重点实验室，安徽 合肥 230012；
4.安徽中医药大学第二附属医院，安徽 合肥 230061)
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种与衰老相关的神经退行性疾病，其发病机制极其复杂，在疾病后期还会导致神经细胞功能丧失和神经细胞死亡，临床表现为记忆损伤和行为失调[1]。目前临床上用于治疗AD的药物只能在一定程度上改善或缓解AD患者的症状，但是未能缓解或阻止疾病的进程[2]。依据淀粉样蛋白级联假说，β淀粉样蛋白(amyloid β，Aβ)是引起AD的主要原因，其在脑内异常分泌和沉积毒害周围的突触和神经细胞，最终造成神经细胞损伤[3-4]。因此，抑制Aβ沉积是预防和治疗AD的关键。
绿萼梅是蔷薇科植物绿梅花ArmeniacamumeSieb. f.viridicalyx(MakinoT). Y. Chen的干燥花蕾，属于理气药，性平，味微酸，归肝、胃、肺经，具有疏肝和中、化痰散结之功效[5]。《本草纲目》中记载梅花具有“助雅致，清神思”的功效，《本草原始》记载绿萼梅能够安神定魂。现代药理研究发现，绿萼梅对神经系统具有保护作用[6]，提示绿萼梅对神经退行性疾病具有预防和治疗作用。人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)分化程度较低，繁殖快,其细胞形态、生理及生化功能与正常神经细胞类似，轴突明显，是研究神经系统疾病的常用模型[7]。课题组前期研究发现，绿萼梅乙酸乙酯萃取部位分离得到的化合物对皮质酮诱导的SH-SY5Y细胞有保护作用[8]。本研究对绿萼梅水提物经大孔树脂不同洗脱部位的抗Aβ活性进行筛选，同时结合超高效液相色谱-串联四极杆飞行时间质谱(ultraperformance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF/MS)定性分析抗Aβ活性部位的化学成分，为绿萼梅的进一步开发和利用提供依据。
1.1 试剂 人神经母细胞瘤细胞株(SH-SY5Y细胞)：美国模式培养物集存库(ATCC)；
青霉素-链霉素(批号 71766505)：联科生物技术股份有限公司；
噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT；
批号 0123A18)：北京雷根生物技术有限公司；
胰蛋白酶(批号 112818181228)：上海碧云天生物技术有限公司；
胎牛血清(fetal bovine saline,FBS)：Hyclone公司；
Aβ1-42(批号 J10M9E60422)：上海源叶生物有限公司。
乙醇(化学纯)：上海苏懿化学试剂有限公司；
AB-8大孔树脂(批号 C12115168)：上海麦克林生化科技有限公司；
绿原酸(批号 DST200520-021，纯度≥98%)、芦丁(批号 DSTDL001701，纯度≥98%)、金丝桃苷(批号 DST200628-023，纯度≥98%)、异槲皮苷(批号 DSTDY000601，纯度≥98%)：成都乐美天医药科技有限公司；
乙腈(质谱级)、甲酸(质谱级)、甲醇(质谱级)：美国Fisher公司。
1.2 主要仪器 Xevo G2 QTOF质谱仪、ACQUITY Ⅰ型超高效液相系统：美国Waters公司；
3K15型低温高速离心机：Sigma公司；
TCL-16G-A型高速冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂；
Forma 3111型水套式CO2培养箱：赛默飞世尔科技有限公司；
SW-CJ-2FD型超净化工作台：苏州净化设备有限公司；
TriStar LB941微孔板式多功能酶标仪：德国Berthold公司；
AB-135S型十万分之一分析天平：德国梅特勒上海有限公司；
Milli-Q型超纯水仪：Millipore公司。
1.3 药材 药材于2019年2月购买于安徽省歙县，经安徽中医药大学中药资源中心刘守金教授鉴定为蔷薇科植物绿梅花ArmeniacamumeSieb. f.viridicalyx(MakinoT). Y. Chen的干燥花蕾。
2.1 绿萼梅抗Aβ活性部位的筛选
2.1.1 样品的提取与制备 取50 g绿萼梅药材，按照12、8、6倍量加入蒸馏水加热回流提取3次，每次1 h。合并滤液并浓缩至0.5 g/mL，流经AB-8大孔树脂，依次使用水、30%乙醇、60%乙醇、90%乙醇依次洗脱，减压回收溶剂，分别得到水部位(ST-0)、30%乙醇洗脱部位(ST-30)、60%乙醇洗脱部位(ST-60)、90%乙醇洗脱部位(ST-90)。细胞实验前，将各洗脱部位干浸膏用超纯水超声溶液，再用培养基稀释至所需浓度，0.22 μm滤膜过滤除菌，4 ℃条件下保存。
2.1.2 试剂的配制 Aβ1-42溶于0.01 mol/L PBS缓冲液中，配制成1 mmol/L的母液，4 ℃保存。各绿萼梅洗脱部位分别溶于0.01 mol/L PBS缓冲液中，配制成1 mg/mL的母液，0.22 μm滤膜过滤除菌，4 ℃条件下保存。
2.1.3 细胞培养及分组 SH-SY5Y细胞采用含有10% FBS、青霉素(终浓度为100 μg/mL)、链霉素(终浓度为100 μg/mL)的DMEM/F12培养基，置于5% CO2、37 ℃条件下培养，隔天换液。选取对数生长期细胞，以每孔5×103接种于96孔培养板中。将细胞分成空白对照组(使用无血清DMEM/F12培养液培养)、模型组(含5 μmol/L Aβ1-42的无血清DMEM/F12培养液培养)、绿萼梅各浓度不同洗脱部位组(含5 μmol/L Aβ1-42和1、10、100 μg/mL绿萼梅洗脱部位的无血清DMEM/F12培养液培养)，继续孵育48 h。
2.1.4 MTT测定细胞存活率 孵育结束前4 h，每孔加入20 μL MTT溶液(PBS稀释配置5 mg/mL)。孵育结束后，弃去各孔上清液，每孔加入150 μL DMSO，细胞振荡仪上振荡10 min，待结晶物充分溶解后使用酶标仪在570 nm测定各孔吸光度值OD570。
2.2 UPLC-Q-TOF/MS鉴定活性部位成分
2.2.1 供试品溶液的制备 分别取ST-60及ST-90适量，精密称定。置于5 mL容量瓶中，加入50%的甲醇定容至刻度，超声溶解，制成每毫升含1 mg的样品溶液，经0.22 μm微孔滤膜过滤，续滤液作为供试品溶液。
2.2.2 色谱条件 色谱柱为Thermo Syncronis C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；
流速：0.2 mL/min；
柱温：30 ℃；
流动相：乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)。洗脱梯度：0～6 min，6%→9% A；
6～12 min，9%→13% A；
12～16 min，13%→13% A；
16～26 min，13%→30% A；
26～36 min，30%→40% A；
36～38 min，40%→6% A；
38～43 min，6% A；
进样量2 μL。
2.2.3 质谱条件 ESI离子源，正负离子模式，样品锥电压为40 V，源温120 ℃，脱溶剂气温度450 ℃，脱溶剂气体积流量为800 L/h。采用MSE采集方式，采集时间30.0 min，质荷比(m/z)100～1 200，扫描间隔0.1 s。碰撞能量：碰撞低能量6 V，碰撞高能量为10～35 V。碰撞气为高纯He，雾化气为高纯N2。Lockmass采用亮氨酸-脑啡肽，m/z556.276 6(正离子模式)、554.2615(负离子模式)。数据采集由MassLynx V 4.1软件控制。采用Waters UNIFI软件分析其中各化学成分的保留时间及其质谱信息，并结合其分子离子峰与对照品、文献报道的数据进行对比，再对其中的化学成分进行辨识。
3.1 活性部位筛选实验 绿萼梅抗Aβ毒性作用部位筛选实验结果见图1，与空白对照组比较，模型组细胞存活率显著下降(P<0.05)，说明Aβ诱导的SH-SY5Y细胞模型细胞存活率显著降低。与模型组比较，绿萼梅各浓度不同洗脱部位组细胞存活率均显著上升(P<0.05)，且高浓度不同洗脱部位组细胞存活率大于中、低浓度不同洗脱部位组，说明绿萼梅不同洗脱部位的药效具有浓度依赖性；
ST-60和ST-90提高细胞存活率的效果强于ST-0与ST-30。因此选择ST-60和ST-90进行化学成分分析。
注：与空白对照组比较，*P<0.05；
与模型组比较，#P<0.05
3.2 绿萼梅活性部位辨识 在中国知网、PubChem等数据库中查询并汇总绿萼梅(含梅花)的化学成分，建立包含化合物名称、分子式、相对分子质量等信息在内的绿萼梅成分的一级质谱数据库。根据绿萼梅抗Aβ活性作用部位实验结果选取ST-60和ST-90进行定性分析。其中绿原酸、芦丁、金丝桃苷和异槲皮苷通过与标准品比对保留时间及二级质谱信息进行结构鉴定；
其他化合物通过与UNIFI软件和数据库的自动匹配，结合前期研究基础及文献报道的特征质谱信息进行结构鉴定。从ST-60、ST-90中共鉴定出24个化合物，其中黄酮类16个，苯丙素类4个，其他类化合物4个；
其中14个共有化合物，包括黄酮类10个，苯丙素类2个，其他类化合物2个。ST-60和ST-90正负模式总离子色谱图(total ion chromatogram，TIC)见图2，成分鉴定结果见表1。
表1 ST-60和ST-90的化学成分解析结果
注：A为ST-60正离子模式下TIC，B为ST-60负离子模式下TIC，C为ST-90正离子模式下TIC，D为ST-90负离子模式下TIC
Aβ是由膜蛋白淀粉样蛋白前体蛋白经过β分泌酶和γ分泌酶依次水解产生，具有神经毒性[14]，能使自由基的产生增多[15]，对神经细胞产生氧化应激作用，引起炎症反应，是诱发AD的重要病因之一[16]，因此降低Aβ对神经细胞的损伤是治疗AD的重要途径。SH-SY5Y细胞常用来制备研究神经细胞凋亡的拟神经细胞模型，广泛应用于神经细胞退行性疾病的发病机制和治疗方法的研究[17]。本实验结果显示，ST-60和ST-90对Aβ蛋白诱导的SH-SY5Y细胞模型活性强于其他洗脱部位，且药效呈现浓度依赖性，说明绿萼梅具有抗Aβ活性作用。经UPLC-Q-TOF-MS辨识ST-60和ST-90的化学成分，共鉴定出24个化合物，其中黄酮类16个，苯丙素类4个，其他类化合物4个。从两个洗脱活性部位中鉴定出14个共有成分，分别为芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、紫云英苷、水仙苷、异鼠李素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素、山柰酚、异鼠李素和柚皮素等10个黄酮类化合物，绿原酸和反式羟基肉桂酸等2个苯丙素类化合物，以及腺苷和十六碳二烯酸等2个其他类化合物。结果表明，绿萼梅抗Aβ活性作用的药效物质基础可能是黄酮类化合物。
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