后火低温大曲曲皮和曲心细菌多样性及基因功能预测
时间：2023-01-28 14:00:04 来源：天一资源网 本文已影响 人 
刘忠军，冯廷闯，刘继明，钟吉安，蔡文超，郭壮*
（1.湖北文理学院湖北省食品配料工程技术研究中心，湖北 襄阳 441053；
2.襄阳市酿酒生物技术与应用企校联合创新中心，湖北 襄阳 441053；
3.清香型白酒生物技术襄阳市重点实验室，湖北 襄阳 441053）
清香型白酒又称汾香型白酒，是我国白酒的主要香型之一，具有清香纯正、醇甜柔和、自然谐调和余味爽净的特点，以山西汾酒、湖北黄鹤楼和霸王醉为代表，属大曲酒类[1-2]。清香型白酒酿造使用低温大曲，酒曲具有糖化、发酵和生香等作用，是酿酒必不可少的辅料之一[3]。低温大曲微生物类群构成直接影响了白酒的风味品质，因而对低温大曲微生物多样性进行解析是极为必要的。张双燕等[4]对北京地区低温大曲中微生物多样性进行分析发现，乳杆菌属（Lactobacillus）、片球菌属（Pediococcus）、乳球菌属（Lactococcus）、明串珠菌属（Leuconostoc）、醋杆菌属（Acetobacter）和芽孢杆菌属（Bacillus）为细菌优势类群，假丝酵母属（Canndida）、曲霉属（Aspergillus）、毛霉属（Mucor）和维克汉姆酵母属（Wickerhamomyces）为真菌优势类群。周森等[5]对5个不同地区的11种清香型低温大曲微生物多样性进行研究发现，Bacillus、放线菌（Actinomyces）、泛菌属（Pantoea）和葡萄球菌（Staphylococcus）为其优势细菌类群。
低温大曲可分为红心曲、清茬曲和后火曲[6]，其中清茬曲断面一般为灰黄色且无杂色，红心曲断面中间有一道红，而后火曲断面一般会出现两道眉[7]。叶光斌等[8]采用指纹图谱技术对汾酒3种低温大曲的细菌群落结构进行比较亦发现，不同类型低温大曲的细菌群落结构存在一定的差异。后火曲的制作工艺具有重排列、重翻曲以及重热晾的特点，与清茬曲和红心曲的工艺流程基本一致，主要区别为对醅曲的温度要求不同，清茬曲中温大晾，后火曲大热大晾，而红心曲多热少晾[9]。有研究表明3种低温大曲中后火曲的发酵率和产酯量最高[10]。目前关于后火低温大曲中微生物群落的报道较少，关于后火低温大曲曲皮与曲心中微生物多样性的研究亦鲜见报道。
高通量测序技术具有成本低以及能快速实现多个样本间的平行比较的特点，近年来在发酵乳制品[11]、发酵肉制品[12]、发酵豆制品[13]以及发酵蔬菜制品[14-15]中广泛应用，全面解析了其富含的微生物类群[16]。本研究以后火低温大曲曲皮和曲心为试验对象，通过高通量测序技术研究解析了其细菌多样性，同时使用PICRUSt（phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states）软件对其细菌类群的基因功能进行预测，以期为襄阳地区清香型白酒酿造微生物菌株的收集、保藏和筛选提供参考。
1.1 材料与仪器
后火低温大曲：采集自某酒厂曲库。
DNA基因组提取试剂盒：德国QIAGEN公司；
10×聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）缓冲液、脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）酶、脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTPs）：北京全式金生物技术有限公司；
引物27F、1495R、M13：武汉天一辉远生物科技有限公司。
800Y粉碎机：永康市铂欧五金制品有限公司；
Illumina MiSeq高通量测序平台：美国Illumina公司；
R930机架式服务器：美国DELL公司；
Veriti 96孔梯度PCR仪：美国AB公司；
ND-2000C微量紫外分光光度计：美国Nano Drop公司；
CR21N高速冷冻离心机：日本HITACHI公司；
FluorChem FC3型化学发光凝胶成像系统：美国Protein Simple公司。
1.2 试验方法
1.2.1 样品采集
2020年12 月于某酒厂曲库中选取库存30 d～35 d的低温大曲，使用瓦刀将其从中部位置砍断后，根据截面情况对其进行分类，典型的后火低温大曲截面如图1所示。
图1 后火大曲Fig.1 Houhuo Daqu
共选择10个典型的后火大曲，将图1中浅色区域定义为曲皮，使用经酒精擦拭后的刀片将其切下并打成粉，编号为QP1～QP10，将图1中深色区域定义为曲心，亦使用经酒精擦拭后的刀片将其切下并打成粉，编号为QX1～QX10。其中相同数字编号的曲皮和曲心样品来自于同一块后火低温大曲。所采集的后火低温大曲以小麦为主要原料，经润粮、粉碎、加水拌合后加入曲母，混合均匀后填充到模具（37 cm×18 cm×7 cm）中，然后入室发酵，酒曲从入库到成熟经历上霉（35℃～37℃）、晾霉（24℃～28℃）、潮火（40℃～47℃）、大火（32℃～46℃）以及后火期（30℃～38℃）5个步骤，翻曲9次～13次，周期约为 24 d～26 d。
1.2.2 宏基因组DNA的提取、16S rRNA序列扩增及Illumina高通量测序
按照试剂盒中的方法分别对20份样品进行宏基因组DNA提取，参照文献[17]中的方法对细菌16S rRNA序列V4-V5进行扩增，合格的PCR产物进行清洁后寄送至上海美吉生物医药科技有限公司进行Illumina MiSeq高通量测序。
1.2.3 生物信息学分析
参照Zhang等[18]和Wang等[19]的方法对序列进行拼接和质控。使用QIIME（v1.9.1）分析平台对质控后的序列进行生物信息学分析。依次将序列利用PyNAST软件对齐，构建分类操作单元（operational taxonomic units，OTU），比对代表性序列。本研究对同一测序深度下的α多样性指标进行分析，同时基于UniFrac距离的主坐标分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）和UPGMA聚类进行β多样性解析。
若某一OTU在所有后火大曲样品中均存在，则该OTU定义为核心OTU；
将平均相对含量大于1.0%的门和属定义为优势门和属；
若某一OTU在曲皮中均存在，而在曲心中均不存在，则将该OTU定义为曲皮中的特有OTU，反之亦然[20]。
1.2.4 PICRUSt基因功能预测
使用PICRUSt软件对后火大曲曲皮和曲心中细菌的基因功能进行预测，并参照蛋白质直系同源簇数据库（clusters of orthologous groups of proteins，COG）进行注释。
1.2.5 多元统计
使用Past3软件中威尔科克森检验（Wilcoxon test）和多元方差分析（multivariate analysis of variance，MANOVA）对曲皮和曲心样品的差异性进行分析，对关键细菌类群使用 LEfSe（linear discriminant analysis effect size）分析进行甄别。使用Excel 2016、R软件（v4.0.3）、Origin 2017 以及在线网页（https：//www.omicstudio.cn/tool/24）进行绘图。
2.1 α多样性分析
本研究经MiSeq高通量测序发现，20个样品共得到989900条序列，每个样品平均测序深度为49495条。在构建系统发育树的基础上，对曲皮和曲心细菌类群的α多样性进行计算，结果如图2所示。
图2 曲皮和曲心α多样性指标比较分析Fig.2 Comparative analysis of α diversity index in different parts of Houhuo Daqu
由图2可知，当测序深度为40 010条序列时，曲皮和曲心细菌类群的发现物种数分别为1 416±419和1 036±141（平均值±标准差），香农指数的值分别为5.30±0.45和3.55±0.48。使用Wilcoxon检验发现两者的发现物种数差异非常显著（P＜0.01），香农指数差异极显著（P＜0.001）。由此可见，低温后火大曲曲皮中细菌类群丰度和物种多样性均高于曲心。
2.2 基于门和属水平的细菌群落结构分析
纳入本研究的曲皮中的细菌类群可鉴定为34个门和317个属，而曲心中细菌类群仅鉴定为9个门和48个属，低温大曲不同部位优势门和属相对含量比较分析如图3所示。
图3 曲皮和曲心中优势门和属相对含量比较分析Fig.3 Comparative analysis of dominant phyla and genera in different parts of Houhuo Daqu
由图3A可知，曲皮中的优势细菌门为Actinobacteria、Firmicutes和Proteobacteria，平均相对含量分别为58.61%、27.54%和12.94%；
曲心中的优势细菌门为Actinobacteria和Firmicutes，平均相对含量分别为46.85%和52.47%。经Wilcoxon检验发现，Proteobacteria在曲皮中的含量极显著偏高（P＜0.001），其在曲心中的平均相对含量仅为0.079%，Actinobacteria在曲皮的含量显著偏高（P＜0.05），而Firmicutes在曲心中的含量极显著偏高（P＜0.001）。
由图3B可知，曲皮中的优势细菌属分别为隶属于 Actinobacteria的链霉菌属（Streptomyces，34.07%）、糖多孢菌属（Saccharopolyspora，23.45%）和 Staphylococcus（1.14%），隶属于 Firmicutes的 Lactobacillus（12.18%）、Bacillus（10.60%）和 Weissella（1.23%），隶属于 Proteobacteria的 Pantoea（4.12%）、欧氏杆菌属（Erwinia，3.96%）和肠杆菌属（Enterobacter，3.67%）。曲心中的优势细菌属分别为隶属于Actinobacteria的Saccharopolyspora（38.79%）和 Streptomyces（5.68%），隶属于Firmicutes的Bacillus（49.58%）和 Thermoactinomyces（2.36%）。经 Wilcoxon 检验发现，Streptomyces、Lactobacillus、Pantoea、Erwinia 和 Enterobacter含量在曲皮中极显著偏高（P＜0.001），平均相对含量分别为34.07%、12.18%、4.12%、3.96%和 3.67%；
Saccharopolyspora和Thermoactinomyces含量在曲心中显著偏高（P＜0.05），相对含量分别为38.79%和2.36%；
Bacillus在曲心中极显著偏高（P＜0.001），相对含量为49.58%。由此可见，低温后火大曲曲皮和曲心细菌群落结构存在一定差异，而造成这种差异的原因可能在于制曲过程中两个部位所接触的温度、水分以及空气环境有所不同。
2.3 β多样性分析
进一步采用基于UniFrac距离的PCoA和UPGMA聚类对曲皮和曲心细菌类群的β多样性进行分析，结果如图4所示。
图4 基于主坐标分析和聚类分析的β多样性分析Fig.4 Beta diversity analysis based on principal coordinate analysis and cluster analysis
由图4A和图4B可知，曲皮和曲心样品均呈现明显的分离趋势，经MANOVA分析发现，曲皮和曲心样品间差异极显著（P＜0.001），这说明后火低温大曲曲皮和曲心样品间细菌类群存在显著差异。由图4B可知，曲皮QP5样品单独一个分支，其余9个样品形成一个聚类，曲心10个样品形成一个聚类，说明QP5细菌类群与其他样品存在较大差异。
2.4 曲皮和曲心OTU水平的细菌群落结构分析
本研究经过100%和97%相似度进行OTU划分后共得到23 124个OTU，研究发现核心OTU有95个，平均相对含量仅为0.41%。其中平均相对含量＞1.0%的OTU如图5所示。
图5 核心OTU相对含量的瀑布图Fig.5 Waterfall plot of relative content of core OTU
由图5可知，平均相对含量＞1.0%的核心OTU有7个，包含的序列数占总序列数的67.89%。由此可见，曲皮和曲心中共有大量的核心OTU细菌类群。其相对含量分别为 OTU13549（28.34%）、OTU12521（16.64%）、OTU20433（6.46%）、OTU16513（7.82%）、OTU21812（4.97%）、OTU16195（2.42%）和 OTU21622（1.24%），其中OTU13549隶属于Bacillus，OTU12521和OTU20433隶属于 Saccharopolyspora，OTU16513、OTU21812 以及OTU16195 隶属于 Streptomyces，OTU21622 隶属于Thermoactinomyces。进一步说明了Bacillus、Saccharopolyspora、Streptomyces和 Thermoactinomyces为后火低温大曲中的优势属。
本研究发现后火低温大曲曲皮和曲心中均存在特有OTU，结果如表1所示。
表1 曲皮和曲心特有OTU的相对含量Table 1 Relative abundance of unique OTU in different parts of Houhuo Daqu
续表1 曲皮和曲心特有OTU的相对含量Continue table 1 Relative abundance of unique OTU in different parts of Houhuo Daqu
由表1可知，曲皮中存在13个特有OTU，包含序列数占总序列数的比例为0.37%，其中各有2个鉴定为Lactobacillus和Streptomyces，各有1个鉴定为Kocuria、Paenibacillus、Sphingomonas、Staphylococcus和Weissella，而其余4个OTU无法鉴定到属水平。曲心中存在7个特有OTU，包含序列数占总序列数的比例仅为0.07%，其中2个鉴定为Bacillus，1个鉴定为Thermoactinomyces，其余4个OTU亦无法鉴定到属水平。由此可见，后火低温大曲曲皮和曲心均存在部分独特的细菌类群，但其含量较少。
2.5 关键细菌类群甄别
LEfSe分析常用于分类学水平物种特征及差异的认识与揭示[21]。为进一步揭示后火低温大曲曲皮和曲心中菌群的结构差异，本研究使用LEfSe分析进行了甄别，结果如图6所示。
图6 细菌类群的LEfSe分析Fig.6 LEfSe analysis of bacterial taxa
由图6可知，检测到27个（LDA评分在4以上）在曲皮和曲心样品中差异显著（P＜0.05）的分类单元。由图6A可知，曲皮中特定细菌的系统分类地位主要为隶属于放线菌纲（Actinobacteria）和变形菌纲（Gammaproteobacteria），曲心中主要隶属于芽孢杆菌纲（Bacilli）。由图6B可知，有8个丰度差异显著的菌属，其中曲皮中关键细菌类别明显多于曲心样品。曲皮中差异显著的菌属有 5 个，分别为 Streptomyces、Lactobacillus、Erwinia、Enterobacter和Pantoea。曲心中有3个，分别为Thermoactinomyces、Saccharopolyspora和 Bacillus。由此可见，导致后火低温大曲曲皮和曲心细菌群落结构存在差异的主要为Streptomyces和Bacillus等优势细菌属。
2.6 基于PICRUSt功能预测分析
纳入本研究的20个样品共注释到隶属于23个功能大类的4412个COG，结果如图7所示。
图7 基因功能预测热图Fig.7 The heatmap of gene functional prediction
由图7可知，氨基酸转运和代谢、碳水化合物运输和代谢以及转录在后火低温大曲中细菌类群中有较高表达，而在RNA的处理与修饰、染色质结构与动力学及细胞骨架的表达较低。Weissella有一定的耐酸性，能分解葡萄糖产生乳酸，有利于乳酸乙酯的形成[22]。Bacillus可产生蛋白酶、乳酸以及淀粉酶等，可有效降解大分子蛋白为肽类和氨基酸，从而促进人体消化吸收[23]。Saccharopolyspora能产生酶类、维生素降解促进因子[24]，Thermoactinomyces可产蛋白酶和纤维素酶[25]，而这些因素可能是造成后火低温大曲中氨基酸转运和代谢、碳水化合物运输和代谢等功能较强的原因。经Wilcoxon检验发现，曲皮中细菌在细胞骨架的表达上非常显著偏高（P＜0.01）。
后火低温大曲曲皮和曲心中细菌类群差异显著，曲皮中细菌丰富度及多样性均显著偏高，曲皮中以Streptomyces、Lactobacillus、Saccharopolyspora 和 Bacillus等为主，曲心中以Bacillus和Saccharopolyspora为主。此外，PICRUSt功能预测发现后火低温大曲具有较强的氨基酸转运和代谢、碳水化合物运输和代谢以及转录等功能，曲皮中的细菌类群在细胞骨架的表达上非常显著偏高（P＜0.01）。
猜你喜欢 大曲类群低温 特香型大曲培养条件关键技术优化研究酿酒科技(2022年9期)2022-10-042021贵州大曲杯“记忆里的味道”征文终评结果（各奖项排名不分先后）山花(2021年11期)2021-11-22大型低温制冷技术新突破军事文摘(2021年16期)2021-11-05低温热水地板辐射采暖浅析建材发展导向(2021年11期)2021-07-28两宋大曲异同考戏曲研究(2020年2期)2020-11-16唐雅乐大曲存辞考略中华戏曲(2020年1期)2020-02-12甘肃民勤连古城国家级自然保护区不同生境土壤动物群落的组成及多样性绿色科技(2019年14期)2019-11-19薏苡种质资源ISSR分子标记筛选及亲缘关系分析江苏农业科学(2019年5期)2019-09-02苗圃国槐林和沙棘林春季大型土壤动物群落格局差异绿色科技(2018年19期)2018-11-29零下低温引发的火灾劳动保护(2018年8期)2018-09-12 相关关键词： 胆大心细 教师爱心耐心细心责任心 心细
