科研思路和方法作业要点
时间：2020-08-11 08:18:30 来源：天一资源网 本文已影响 人 
从MHCⅠ/Ⅱ类探讨针灸对带状疱疹的免疫逃避作用
研究内容、研究目标、以及拟解决的关键问题
1课题以MHCⅠ/Ⅱ类基因围绕IFN-和的途径，有目的地观察IFN-和相关MHCⅠ、MHCⅡ的表达量、分布及变化规律，进一步检测的表达变化以及的动态变化，并对上述指标的相关性及变化规律进行分析，说明是灸、的关键。
且明确针刺与作用机制的差异。
主要开展以下工作：
IFN-γ、CⅡTa、Stat1α、Jak1、Jak2、MHCⅠ、MHCⅡ、蛋白的表达及分布规律。
（5）western blot检测：IFN-γ、CⅡTa、Stat1α、Jak1、Jak2、MHCⅠ、MHCⅡ蛋白量的表达。
（6）RT-PCR法2.研究目标：
旨在明确灸，，与MHCⅠ/Ⅱ类表达关系
2.2.2通过针灸理论。
2.2.3旨在明确与作用差异。
3拟解决的关键性问题：
MHCⅠ/Ⅱ类拟采用的方案及可行性分析
1拟采用的方案
实验环境：实验室相对封闭，自然采光，环境温度控制在20～25之间，湿度控制在60%左右。实验动物：级，体重22～24g笼养，自由饮食，由实验动物中心提供全价动物颗粒饲料。
.1分组及造模：
腹腔注射，，。
模型组：造模方法同上每天陪同正常组、针刺组、组固定，连续天。药物组：造模方法同上。左侧腹腔注射ACV0.1g/kg/d，连续三天，每天陪同正常组、针刺组、组固定，连续天。针刺组：造模方法同上。按照造模时间的先后顺序，在造模完成后，开始针刺，进针0.2～0.3mm，留针10min，每1次，连续天。
组：造模方法同上。按照造模时间的先后顺序，连续天。
组：连续天。正常组：腹腔注射生理盐水。每天陪同模型组、针刺组、艾灸组固定，连续天。
1.2 取材方法：
造模后随机处死8只取材鼠针刺组、组后随机处死8只鼠取材。取材放入-80oC低温冰箱保存、备检。
1.3穴位选取：
固定鼠方法：根据鼠的形体，在木板上钉上四个适当距离的铁钉，将夹子套在铁钉上，用夹子夹住鼠的四肢以做固定。鼠穴位定位参考《实验针灸学》，模拟鼠的定位方法：“大椎”在第七颈椎与第一胸椎间；“膈俞”在第七胸椎下两旁肋间，左右侧各一穴；“尺泽”在1.4 观察指标及方法：各组鼠每天定时，专人割尾静脉采血0μl，加入0.38ml的白细胞稀释液中，摇匀，静置3分钟，查外周血白细胞数和细胞分类计数制备样品：处死动物，用流细胞仪上机检测并进行分选。流细胞仪检测：将分选细胞清洗、离心(1500RPM10min)，清洗两次，弃上清；加入PI荧光标记抗体；用流细胞仪分别检测分析方法：测出的数据经PHOENIX公司分析软件Multicycle处理得出细胞各周期的相对含量和百分数,并绘出DNA分布的直方图。
IFN-γ、CⅡTa、Stat1α、Jak1、Jak2、MHCⅠ、MHCⅡ、蛋白的表达及分布规律。
① 制备样品：处死动物，取股骨骨髓，10%福尔马林固定标本，石蜡包埋，4μm厚切片。
免疫组化染色检测方法：鼠抗人IFN-单克隆抗体(DO-27)（，浓度1:50）；鼠抗人 cyclinD1单克隆抗体（DCS/6）（NeoMarker福州迈新公司，浓度1:100）；鼠抗人单克隆抗体MHCⅠ、MHCⅡ（晶美公司）；S-P免疫组化试剂盒（北京中山公司）。：
③ 分析方法：IFN-MHCⅠ、MHCⅡ免疫组化阳性信号均为棕黄色细颗粒状，染色结果按阳性细胞百分比及染色强度综合记分作半定量分析。
western blot检测：IFN-γ、CⅡTa、Stat1α、Jak1、Jak2、MHCⅠ、MHCⅡ蛋白量的表达。
①制备样品：取样品1×106～1×107细胞，PBS清洗，去PBS加0.1～1ml总蛋白抽提试剂抽提总蛋白使用KCTMBCA蛋白质定量试剂盒，测定样品浓度。
方法：变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳(SDS)蛋白质转移到硝酸纤维膜，30mA恒流，4°C转移，过夜膜在5％BSA溶液中室温孵育1小时，加入一级抗体室温孵育1.5小时；加入HRP标记的二级抗体，室温孵育1小时化学发光法检测，X胶片曝光显影。
分析方法：扫描图片，用ImageJ分析软件将图片上每个特异条带灰度值数字化；将目的蛋白灰度值除以内参GAPDF的灰度值，校正误差，所得结果代表某样品的目的蛋白相对含量。
法 提取总RNA：取标本，用试剂(GIB-CO公司，美国)提取总RNA，溶于无RNA酶的灭菌超纯水中，用紫外分光分度计测定总RNA的浓度和纯度，同时琼脂糖电泳观察其完整性。将RNA稀释成1mg/L，-80°C保存。
② MHCⅠ、MHCⅡ和β-actin引物序列
MHCⅠ: 5’- TGTCCCGGCCCGGCCTCGGG-3’
5’-TCTCAGCAGGGTAGAAGCTA- 3’
MHCⅡ: 5’-ACCAACGGGACGAGCGCAT-3’
5’-CAAGCCGCCGCAGGGAGGTG-3’
β-actin: 5’- AACGGCTCCGGCATGTGCAA - 3’
5’-CTTCTGACCCATGCCCACCA-3’
PCR反应体系30μl，转录产物3μl，2U Taq DNA聚合酶，10mmol/L 4×dNTP 2μlPOLβ和β-actin引物。
反应条件：94°C预变性；94°C 50s，55°C 55s，72°C 60s，72°C 10min共30个循环。
分析方法：产物经SYNGENE凝胶成像系统分析，以目的基因和β-actin积分灰度值的比值，作为目的基因mRNA的相对表达量。
3.可行性分析：
1、、显示出；
、研究思路清晰，目的明确，有成熟的理论指导所选指标针对性强研究方案可行，研究方法及技术路线成熟；
4、实验室的软件、硬件设备完全具备科研条件。实验室条件先进，课题所需仪器设备均已具有，所需试剂、抗体均可购买。5、课题组成员层次结构、知识结构合理
4.本项目的特色与创新之处1、首次开展针灸对研究进一步揭示针灸的分子生物学机制，
2、通过研究对调节，更具意义。3、探讨与差异为不同病理相关疾病提供依据。
年度研究计划及预期研究结果
200.01-2008.06 建立动物模型，进行细胞分选及各项检测的预实验。2008.07-2009.07 扩大样本数量，应用流式细胞仪、免疫组织化学方法、estern Blot法、RT-PCR法等方法，完成所有实验。
20.08-2010.12 完成统计学处理，进行课题总结。
预期研究结果本课题通过观察针对MHCⅠ/Ⅱ类相关酶类和蛋白的影响，从而揭示针灸对作用新的分子生物学机制，为针灸在疾病中的应用提供可靠的依据，丰富针灸的科学内涵为疾病提供新的治疗思路和方法明确针刺与作用机制的差异（二）研究基础与工作条件1. 文献掌握情况近20年来国内外有关的相关文献，尤其是近10年的有关中、西医治疗的临床和实验研究的论文，较全面的掌握了本研究的最新科研动态。
预研究情况预研究 现有技术力量本课题分别课题，具有较强的科研能力、、试剂
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免疫组化法检测IFN-γ、CⅡTa、Stat1α、Jak1、Jak2、MHCⅠ、MHCⅡ蛋白表达及分布规律
Western blot检测IFN-γ、CⅡTa、Stat1α、Jak1、Jak2、MHCⅠ、MHCⅡ蛋白表达量
得出结论、撰写论文
RT-PCR方法测定:表达率和表达量
左侧腹腔注射ACV0.1g/kg/d
Spss统计分析
皮损组织病理学观察
外周血有核细胞计数、白细胞、淋巴细胞分类计数、巨噬细胞吞噬功能。
正常组给予同体积的生理盐水；针刺组10min/次/天，组次/天，组模型组陪同固定。
以上各组在造模后后每天相同时间，分别进行相应处理，并作动态观察。
放血组
针刺组
模型组
正常组
CTX100mg/kg/d，连续3天
鼠
相关关键词： 关键步骤的思路和要点
