实验一_鸡新城疫血凝(HA)和血凝抑制(HI)抗体水平测定法
时间：2020-08-30 08:53:08 来源：天一资源网 本文已影响 人 
鸡新城疫血凝(HA)与血凝抑制(HI）抗体水平测定法
１.本次实验得目得与要求
掌握鸡新城疫血凝（ＨA)与血凝抑制（HI）抗体水平测定法,以便检查疫苗使用效果与制定合理免疫程序.
２.实验内容或原理
某些病毒(如新城疫病毒，禽流感病毒等）能够与动物得红细胞发生凝集，此即为红细胞凝集现象(HＡ）。这种红细胞凝集现象可于病毒悬液中加入特异免疫血清所抑制，即为红细胞凝集抑制试验（HI)。
３．需用得仪器或试剂等
动物 健康成鸡2-5只,被检鸡１5—2５只。
器材 高压灭菌器、滤纸、试管、试管架、离心机、离心管、三棱针、内径2mm聚乙烯塑料管100cm、酒精灯、石蜡、96孔V型微量凝集试验板、0．02５mm微量吸液器、微型振荡器、微量移液器、脱脂棉等。
药剂（１)浓缩抗原;(２)生理盐水或磷酸缓冲盐水(PＢS)；(3）Alsｅver细胞保存液；(4)红细胞悬液;（5)待检血清
4。实验步骤
（１)发现与鉴定病毒：鸡新城疫与禽流感病毒分离后，这些病毒能凝集鸡得红细胞，又能被特异性得已知免疫血清抑制其凝集反应,即可鉴定此病毒。
?(２）诊断病毒性疾病:如取同一发病得动物早期与恢复期血清进行红细胞凝集抑制实验,如抗体效价有4倍以上升高，即有诊断意义.
(3)免疫机体抗体效价得测定：
?３、鸡新城疫(ND)得HA与HI
（1）试验准备
?①?抗原：一般以鸡新城疫Ⅱ系或LaUｒａ系冻干苗作为已知抗原，进行试验。
?②?０、7％细胞悬浮液：由鸡翅静脉或心脏采血,放入含有抗凝剂得灭菌试管(按每毫升血加入３、8%灭菌柠檬酸钠０、２毫升做抗凝剂)内，迅速混匀。如当时不用,可直接采血放入红细胞保存液内（保存液2份，血液1份）于4℃
红细胞悬液得配制：将血液注入离心管中,经３0０0转／分钟，离心５－10分钟,用吸管吸去上清液与红细胞上层得白细胞薄膜，将沉淀得红细胞加稀释液(生理盐水）洗涤。再用离心机3000转/分钟离心５—1０分钟，弃上清,再加稀释液洗涤，如此反复洗涤三次,将最后一次离心后得红细胞泥,按0、7%得稀释度加入稀释液（0、7毫升红细胞泥加９9、3毫升稀释液）。
?③?被检血清：将被检鸡群编号登记，用消毒过得干燥注射器采血,注入洁净干燥试管内(微量法可用孔径2—3毫米塑料管由翅静脉采血），在室温中静置或离心，待血清析出后使用。每只鸡应更换一个注射器,严禁交叉使用。
④?稀释液:为灭菌得生理盐水.
⑤?红细胞保存液得配制方法：葡萄糖２。05克,柠檬酸钠(SHOO)0.8０克，柠檬酸（2H２0）0
(2)红细胞凝集试验(HA) 主要就是测定病毒得红细胞凝集价，以确定红细胞凝集抑制试验所用病毒稀释倍数(抗原单位）。
鸡新城疫病毒得ＨA试验与HI试验现采用微量法，以u或v形微孔塑料板代替试管。
①?首先用移液器向每个孔加入稀释液一滴(0、０5毫升)。
②?用微量移液器取病毒抗原0、０5毫升,加入第一孔，反复抽动６次后，吸出0、０5毫升加入第二孔，在第二孔反复抽动6次后,吸出０、05毫升加入第三孔,如此连续稀释至第十一孔后吸出0、05毫升弃去。第12孔不加病毒液为红细胞空白对照。
判断：沿着倾斜面向下呈线状流动者为沉淀,表明红细胞未被或不完全被病毒凝集;如果孔底得红细胞铺平孔底,凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集.
如上例:病毒液得HＡ效价以出现完全凝集得抗原最大稀释度为准.HI试验时,病毒抗原液为0、05毫升内须含4个凝集单位,则应将原病毒液作成64／４=1６倍得稀释液。
孔号: 1
2 3 ４
5 6 7 8
９
１0
11 12
滴度：
１：2 1：４ 1：8 1：１６ １:３２ 1：64
1：1２8 １：2５６ 1：５17 1：1０24 1：２０４8 对照
稀释液 25 25 25 2５ 2５ ２５
25 25
25 ２5 25 25
抗原（病毒) 25 25 25
２５
2５ ２5
２5
2５ ２5 25 2５
红细胞悬液 2５ 25 ２５
25 2５
2５ 2５ 2５ 25 2５
２5 ２５
作用时间与温度 轻轻振荡１-2mｉｎ
静置3０-60min
结 果 +＋+ +＋+ +++ ++＋ +++ +++ ++ ﹣
﹣ ﹣ ﹣ ﹣
注意：＋++为完全凝集 ++为部分凝集 — 为不凝集
(3)红细胞凝集抑制试验（HＩ试验）：新城疫病毒凝集红细胞得作用，能被特异性抗体抑制，因此，可用HI试验(简称血凝抑制试验）测定鸡血清中得HI抗体效价(滴度），并可用标准血清,作新分离病毒得鉴定与未知病毒得诊断.
微量法:具体操作如下:
?①用移液器向每孔加0、05毫升稀释液，十一孔加0、1毫升.
?②用移液器吸取被检血清(或高免卵黄抗体)０、05毫升注入第一孔，抽放6次后，吸出0、０5毫升，注入第二孔,如此连续稀释至第１0孔，并从第十孔吸出0、05毫升弃去,血清稀释倍数依次为１:2～1０24,11孔与１2孔空白。
③?每孔再加入已标定好得四单位病毒液0、05毫升,第十一孔为红细胞对照孔,不加病毒液。
④?置振荡器上振荡１-2分钟,放18～2２℃静置20分钟。
⑤?每孔再加入0、7％红细胞悬浮液0、05毫升，放振荡器上振荡l－2分钟，置1８-2２℃，３0-
⑥?第十一孔为红细胞对照孔，第十二孔作为抗原对照孔。
ＨI试验与结果
孔号
1 2 3 4 5 6 ７ 8
9
10 １1 １2
被检血清
稀释倍数
红细胞
抗原
1：２ 1：4 1：8 １:１6
１：32 1：64 1：1２8 1：2５6 1：5１2 １:1024 对照 对照
稀释液
被检血清
25 25 2５ 2５ ２５ 25
25 25 2５ 2５ ５0 25
２5 ２５
２５ 25 2５ 25 2５ ２5
２5 ２５
弃去
稀释液
标准阳性血清
2５ 25 ２５ ２5 2５ 2５ 25 ２5 ２5 25 50
２5
2５ 25 25 25 25 25 25 2５ ２５ ２5 弃去
4单位病毒
２５ 2５ 25 25 ２５ 25 25 ２5 2５ ２5 25
作用时间
与温度
振荡１—2min，静置20 mｉn
红细胞悬液
25 25 2５ 2５ 25
25 25 ２5 2５ 25 ２５ 2５
作用时间
与温度
振荡1-２min,静置30-60 ｍiｎ
结果1
-
— — — — -
++ ++＋ +＋+ +++ - +++
结果2
—
— - —
—
- — — — +++ — +++
结果观察：将反应板倾斜成４5℃
能将4单位病毒物质凝集红细胞得作用完全抑制得血清最高稀释倍数，称为该血清得红细胞凝集抑制效价，用被检血清得稀释倍数或以2为底得对数(ｌog2）表示.如上例，该血清得红细胞凝集抑制效价为1:64或HI效价为6（ｌog2）。第十一孔仅含稀释液与红细胞为不凝集对照孔,第十二孔含稀释液,病毒液与红细胞为凝集对照孔。
结果分析如下：
①? 一般认为鸡得免疫临界水平为1：8(成年）或1：16（雏鸡)，但随地区不同而有差异。
②鸡血清得ＨI抗体效价高于1：16时可适当推迟新城疫免疫得时间,ＨＩ抗体效价在１:16以下，须马上进行新城疫疫苗接种,在新城疫流行得地区或鸡场，鸡得免疫临界水平，应再提高。
③?鸡群得HI抗体水平就是以抽检样品得HI抗体效价(1og2)得平均值表示得。
如果某鸡群得10份样品中,HI抗体效价为８得有３份样品，为7得有5份样品,为６得有２份样品,它们得平均值为：
平均水平在4（ｌog2），说明该鸡群为免疫鸡群。若在检样中HI抗体效价得最高值与最低值相差太大时，则不能用上法计算平均水平，应根据临界水平以下得样品数在全部样品中所占得百分比决定免疫与否.
④?大型养鸡场,每次进行抽测时，抽样率一般不低于0、1%～０、5％,小型鸡群，抽样率应有所增加，一般认为理想得抽样率应为２％。
⑤?鸡群接种新城疫疫苗后，经2～3周测血清中得HI抗体效价，若提高2个滴度以上，表示鸡得免疫应答良好,疫苗接种成功;若HI抗体效价无明显提高，表示免疫失败。
附注：
①采用HA试验对各生物药厂生产得新城疫疫苗产品有质量检测作用。
②采用HＩ试验对各厂家生产高免血清及卵黄抗体有质量检测作用.
实验二 兔有机磷中毒得诊断与治疗
本次实验得目得与要求
掌握有机磷中毒得诊断要点
熟悉有机磷中毒得简易检验方法。
了解有机磷中毒得解毒原理与治疗措施。
２．实验内容或原理
１、阿托品（Aｔropinum）抗胆碱药
原理：通过阻止乙酰胆碱与受体得结合而产生抗胆碱作用。但有机磷中毒病畜对阿托品得耐受性较高,故需用常规剂量得2（牛)～4（羊）倍。
２、氯磷定(Pyrａlｏxｉmi Methyl－Ｃhｌorｉａuｍ，PAM-CL或2－PAMCＬ)为胆碱酯酶复活剂。
原理：能与磷酰化胆碱酯酶中得有机磷结合,使胆碱酯酶释放并恢复其水解乙酰胆碱得活性；还能直接与有机磷结合为无毒物质排出体外。
3.需用得仪器或试剂等
动物：有机磷中毒病例,或用试验动物(猪或兔）做人工病例复制。
器材:测瞳尺、磁反应板、磁蒸发皿、乳钵、分液漏斗、分液漏斗架、离心机、培养皿、玻璃容器、量筒、棕色玻璃、玻棒、微量吸管、２５ml滴管、注射器、针头、听诊器、体温计、定性滤纸、新华滤纸、试纸、纱布、脱脂棉、剪刀、解剖器械、载玻片、皮筯等.
药物试剂：氯仿、氯化乙酰胆碱、溴麝香草酚蓝、无水乙醇、干燥马血消化、饱与溴水、０、4mol／L氢氧化钠液，二氯甲烷、酒石酸、苯、三氯醋酸、无水硫酸钠、弗罗里矽士、丙硐、石油醚、蒸馏水、注射用水、精制敌百虫、0、5％硫酸阿托品、氯磷定、解磷定、双复磷、碘酊棉、酒精棉等。
4.实验步骤
一、诊断要点
(一）流行病学调查
（二）生前症状:主要为胆碱能神经受过量乙酰胆碱得作用所引起得过度兴奋现象。出现以下三类症候群。
1、草蕈碱样症状
2、烟碱样症状
3、中枢神经症状
（三）有机磷检验
1、检品得采取与处理
2、有机磷检验法
（1)酶化磷检验法
（2)B、Ｔ、B全血试纸片法
（四）病理变化
二、治疗措施
具体方法为：①静脉注射阿托品1/3量得２%溶液以迅速取得效果;②皮下注射阿托品２／3量得生理盐水溶液以取得持续效果；③分点皮下注射氯磷定或其她胆碱酯酶复活剂得生理盐水溶液。必要时重复使用.
1、阿托品（Atroｐinum)抗胆碱药。
2、氯磷定（Pyraloｘｉmi Mｅthy Cｈlｏriaum,ＰＡＭ—CＬ或2－PAMCL）为胆碱酯酶复活剂。
3、解磷定(Pyｒａloxｉmｉ Ｍethiodiduｍ,PＡM）胆碱酯酶复活剂.
4、双复磷（Toｘogｏniｎｕｍ，DMＯ－4)亦为胆碱酯酶复活剂。
5.教学方式
讲述与实验
6.考核要求
实验报告
7。实验报告要求
1、有机磷中毒得诊断要点有哪些?
2、治疗在机磷中毒得最好方案就是什么？其理论基础何在?
实习三 禽霍乱(禽巴氏杆菌病）诊断技术（综合性）
（三个实验计9学时）
1。本次实验得目得与要求
(1）观察家禽巴氏杆菌病得临诊表现与病理解剖变化
（2）掌握禽巴氏杆菌病得微生物学诊断方法
2。实验内容或原理
根据典型症状与病变,以及在显微镜下检查组织涂片发现得两极染色得杆菌，可初步诊断本病。但确诊应依靠病原分离鉴定，病原分离鉴定原理为革兰氏染色法。
3.需用得仪器或试剂等
动物:鸡、小白鼠
器材：外科镊子、外科剪、灭菌纱布、载玻片、糖发酵管等。
药品:草酸铵结晶紫、革兰氏碘、碳酸复红、瑞特氏染液、美蓝染液、棉拭子、接种环、葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、甘露醇、鼠李糖、戊醛糖、纤维二糖、绵子糖、菊糖、赤藓糖、戊五醇、M—肌醇、水杨苷。胰蛋白酶、L—胱胺酸、琼脂粉、酚红。
４.实验步骤
一、临床症状与病理变化
⒈ 症状
(1)急性症状：描述
(２)慢性症状：描述
⒉ 病理变化:描述
二 、微生物学诊断
⒈ 抹片得制备
用镊子夹持病变组织肝或脾，然后以灭菌剪刀剪取小块,夹出后将其新鲜切面在载玻片上压印或涂抹成薄层;若取血液，用灭菌剪刀剪开心脏进行蘸取或剪取凝血块，用新鲜切面在载玻片上压印或涂抹成薄层。自然干燥。将干燥好得抹片，涂抹面向上,以其背面在酒精火焰上来回通过数次,略作加热进行固定。
⒉ 革兰氏染色法
固定好得抹片上滴加草酸铵结晶紫色液,染色2mｉｎ→水洗+加革兰氏碘溶液于抹片上媒染2miｎ→水洗→加95％酒精于抹片上脱色1miｎ→水洗→加稀释碳酸复红复染30ｓ→水洗→吸干→镜检.巴氏杆菌为革兰氏阴性球杆菌或短杆菌，单个或成对存在,常有荚膜.
⒊ 其她染色法
甲醇固定,瑞特氏或美蓝染色呈两极浓染得菌体.
⒋ 病原分离
(1)病料得采集:最急性与急性病例可采集死亡禽只得肝、脾、心血;慢性病例一般采集局部病灶组织；对不新鲜或已被污染得样品,可自骨髓中采取病料.采病料时用烧红得刀片烧烙组织，而后用灭菌棉拭子或接种环通过烧烙表面插入组织或心血内取样。如果为活禽,可通过鼻孔挤出粘液，或将棉拭子插入鼻裂中取样。
(2）培养基制备：马丁琼脂培养基（本实验中采用该培养基）、5％鸡血清葡萄糖淀粉琼脂、鲜血琼脂培养基。
（3)动物接种:如果病料污染严重，则可将0、2mL碾碎得病料，经皮下或腹腔内接种家兔、小鼠或易感鸡,接种动物在２4h～48h内死亡,可以从肝脏、心血中分离到巴氏杆菌。
（４）培养：将病料接种于马丁琼脂培养基在3５℃～37℃下培养，经１8h~24h培养后菌落直径为１ｍm~
注意：如果病料未污染，(3)、(4)步骤可省略。
⒌ 病原鉴定
（1)培养特性:为兼性厌气菌,生长最适温度为35℃～3７℃，经18h～2４h培养后,菌落直径为l mｍ～3mｍ
(2)镜检：从菌落上挑取少量涂片,干燥，固定、染色、镜检同上。
（3）生化鉴定：
1．糖发酵试验：取纯培养物分别接种葡萄糖、单奶糖、甘露醇、蔗糖、麦芽糖、乳糖、鼠李糖发酵管，3７℃培养2～3d,观察结果。? 2.吲哚试验:取纯培养物接种蛋白胨水，37℃培养2～3d,加入吲哚试剂，观察结果。
３．硫化氢试验:取纯培养物接种醋酸铅琼脂,３7℃培养18～24h,观察结果。? 4。对紫乳作用得观察：取纯培养物接种紫乳培养基，37℃培养2～3ｄ,观察结果。?巴氏杆菌生化试验
细菌名称
葡萄糖
乳糖
麦芽糖
甘露醇
蔗糖
单奶糖
鼠李糖
吲哚试验
H2Ｓ试验
紫乳作用
动力
巴氏杆菌
+
—
－
?+
+
+
－
+
+
—
-
注: + 糖发酵试验中表示产酸不产气、其它试验中表示阳性； - 阴性。
⒍ 动物试验 ? 1．取病料制成1：１０乳剂，或用细菌得培养液。
2。取0、2～0、5ｍl皮下注射小白鼠，经24~48ｈ动物死亡。置解剖盘内剖检观察其败血症变化，同时取心血、肝、脾组织涂片，分别进行美蓝染色或瑞氏染色、革兰氏染色，镜检可见大量两极浓染球杆状得巴氏杆菌,革兰氏染色阴性。
7、 结果判定:
依据病原分离培养特性、生化鉴定、动物接种试验可作出确切诊断。
5．教学方式
讲述与实践
6。考核要求
实验报告
7。实验报告要求
⒈ 禽巴氏杆菌病得临诊表现与病理解剖变化？
⒉ 疑似巴氏杆菌病得病鸡，如何进行微生物学诊断？
实验四 止血、缝合、打结与绷带技术
1.本次实验得目得与要求
了解并掌握外科临床上常用得止血法、缝合法、打结法与绷带包扎法得操作要领及操作技术,以便能对家畜得损伤性疾病(如创伤、骨折等）采取必要得急救措施，以利于病畜得进一步合理治疗；同时也为进行某些小手术奠定基础.
2。实验内容或原理
3.需用得仪器或试剂等
动物：狗
器材：外科镊子、外科剪、持针钳、缝针、拆线剪、敷料钳、止血钳、止血带、灭菌纱布、脱脂棉、卷轴绷带、缝合线、细绳、竹片或薄木片等.
药品：肾上腺素溶液或麻黄素溶液。
４．实验步骤
一、止血法
1、指压止血法
２、填塞压迫止血法
3、钳压止血法
4、止血带止血法
5、结扎止血法
(1）单纯结扎止血法
（2）贯穿结扎止血法
6、药物止血法
二、打结法
三、缝合法
1、单纯缝合法
（１)结节缝合法
（2）减张缝合与圆枕缝合法
(3)钮孔状缝合法
(4)螺旋形缝合法
2、内翻缝合法
(1)间断内翻缝合法
（2）连续内翻缝合法
（3)袋口状缝合法
3、外翻缝合法
（1）间断外翻缝合法
(2）连续性外翻缝合法
四、绷带法
（一)卷轴绷带
1、环形绷带
2、螺旋绷带
3、蛇形绷带
4、折转绷带
5、交叉绷带
6、结节绷带（蹄绷带）
7、尾绷带
（二)结系绷带
(三）夹板绷带
5.教学方式
讲述与实践
6.考核要求
实验报告
7。实验报告要求
1、反复练习平结、外科结及三重结得打结方法,达到熟练程度.
２、自行练习单纯缝合法,并写出体会。
六、实验教材及主要参考资料
山西农业大学主编,《兽医学实习指导》，中国农业出版社，2003年
相关关键词： 鸡新城疫
