免疫组化关键步骤、常见问题和解决方案

时间：2020-08-11 08:18:20　来源：天一资源网本文已影响人

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　免疫组化的关键步骤、常见问题和解决方案

　（南京市中医院病理科江苏南京 210001）【摘要】免疫组织化学技术是广泛应用于临床病理实验室的一项基本技术，操作简单，灵敏度高，特异性强，对辅助临床治疗方案和鉴别诊断都有特别的应用价值。但是要保证每一批实验结果的准确性、可靠性，就需要注意每次操作的细节，并需要日积月累的经验总结。下面是本人对免疫组化中一些细节问题的体会。【关键词】免疫组化；问题；方案材料和方法【中图分类号】R319 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2015）32-0337-02 免疫组化技术已广泛应用于临床病理实验室，几乎各个三甲医院都开展了免疫组化技术，为辅助病理诊断和临床治疗、化疗方案提供了很好的帮助，但是要保证每一批实验结果的真实性、可靠性，确实比较难，因为不同的医院做出来的免疫组化结果偶尔会发现不太一样，这就对我们技术人员有一个很高的要求，那就是要注意每次操作的细节，并要日积月累的经验总结，笔者从事病理技术工作近10年，做了近万项免疫组化片子，对免疫组化染色的关键步骤，常见问题和解决方案都一些深刻体会，本文就这些内容来总结一下。1.临床资料我院免疫组化制片一年近1500项，包括肠癌标本、胃癌标本、乳腺癌标本、间质瘤标本、神经内分泌癌标本，淋巴瘤标本，都需要进行免疫组化染色，帮助临床辅助化疗和鉴别诊断。对于每次做完一批免疫组化后，我们都会进行质控。质控的主要目的是发现假阴性或阳性定位是否准确，是否有非特异性背景染色，下面是笔者在工作过程中发现一些必须注意的问题。1.1标本取材前固定应注意的问题为了达到保存良好的组织形态结构，防止组织自溶和保存某些特殊抗原的目的，需要对组织进行及时固定。手术切下来的标本要尽早把他放入固定液中，对于一些大的器官或组织，需要剖开固定，固定液最好采用10%中性缓冲甲醛液。固定时间对抗原的影响：固定不足，使组织中心部位的一些抗原溶解、弥散、丢失，而固定时间过长，抗原掩盖的程度就过重，也不能获得良好的免疫组化染色结果。1.2 标本取材、固定、脱水、透明浸蜡中应注意的问题对于需要做免疫组化的标本，取材的要求与常规略有不同，组织不能过大，以免浪费试剂，过大的组织也给操作带来不便，特别是画圈时也不好画，因为组织过大，盖满了整个玻片时就没有画圈的空隙。现在大部分医院都用全自动组织脱水机，需要时常进行质控，经常更换脱水液，透明液，保证组织脱水、透明充分，浸蜡温度不要过高，否则将破坏某些抗原的成分。

　1.3 脱蜡至水洗中应注意的问题脱蜡液应经常更换，必须保证脱蜡干净，彻底，水洗充分，水洗之后切片应放在蒸馏水中清洗1～2遍，脱蜡不干净，不彻底时，就会出现非特异性着色，影响染色效果，即阳性强度也会减低。1.4 抗原修复中应注意的问题目前常用的抗原修复液有两种：即0.01M柠檬酸缓冲液（PH6.0）和1mM的EDTA缓冲液（PH9.0或PH8.0）.对于一些胞浆阳性或胞膜阳性的抗体，选择柠檬酸缓冲液比较好，而对于一些胞核阳性的抗体，选择EDTA缓冲液比较好。配置修复液时必须用蒸馏水，否则染色会失败，大部分抗体都会出现假阴性。抗原修复方法目前比较常用的是高压锅喷气2～3分钟，中火（120℃～140℃）。自然冷却，如果要节省时间，可用自来水冲洗高压锅外面，等到压力降下，再把高压锅锅盖打开，放在冷水中冷却，中途可换一次水，这样既节省用水，又可节约时间，等到高压锅中水温接近常温，就可直接用自来水冲洗切片[1]。1.5 滴加抗体前和滴加抗体时应注意的问题切片冲洗好后，应放在蒸馏水中，拿出画圈，画圈时应注意圆圈与组织必须保持一点距离，否则会产生边缘效应，即圆圈旁组织会产生非特异性染色。画好圈后，用PBS冲洗切片，注意画完圈后尽量不要让切片干燥，画完圈后也不能立时冲洗，要等油干燥后再冲洗，否则油就冲掉了，就不能起到防止抗体外溢的效果。用蒸馏水配置PBS时，需加一些吐温或去垢剂，有利于冲洗的更干净，也有利于滴加完抗体后抗体的弥散速度，抗体弥散速度快，操作简便，节约时间。一抗孵育可选择37℃温箱1小时或4℃冰箱过夜，而二抗的孵育一般都是室温，添加二抗前和显色前，PBS都必须彻底冲洗干净，否则会产生非特异性着色。1.6 显色时应注意的问题在保证显色液配制浓度准确的情况下，显色时间应严格把握。当制作大批切片时，可以批量滴加显色液，先用肉眼观察组织是否变黄，若变黄时，可在镜下控制，每种抗体的显色时间，背景着色能都不太一样，具体可在镜下控制，积累经验。一般显色时间控制在1～10分钟。1.7 苏木素村染时应注意的问题既然是村染，就要求苏木素染色不应过深，只要胞核淡淡的着色就好。村染后也应保证脱水、透明彻底，否则会有水珠影响观察。封片不要有气泡，最好是湿封，这样会减少在显微镜下观看有裸核的发生，中性树胶的量要把握好，不能过多或过少，一般视盖玻片和组织大小而定，以免溢胶或封不完全[2]。2.结论免疫组化技术虽然操作简单，但是要保证每一批切片染色结果的准确性，可靠性，需要从各个环节，各个细节把握，也需要不断总结，发现问题，积累经验，经常进行学术交流，特别是对一抗的选择，需要长期的试验，总结，对于浓缩型抗体的配置，则需要找到合适的抗体稀释度，那就需要做对照试验。

　【参考文献】[1] 任学军,江昌新. 煮沸法在石蜡切片抗原修复中应用的探讨[J].天津医科大学学报,2011,(01):108-109.[2] 孙青,张传森. 病理诊断与技术操作手册[M].济南:山东大学出版社,2002.99-100.

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